Вопрос 5. Классификация ферментов дыхания
активирование водорода в молекуле дыхательного субстрата и отделение его от окисляемого вещества, или дегидрирование.
активирование молекулярного кислорода, т.е. катализируют заключительные этапы окисления.
Катализируют реакции присоединения к окисляемому субстрату кислорода воздуха
активирование водорода в молекуле дыхательного субстрата и отделение его от окисляемого вещества, или дегидрирование.
Катализируют реакции присоединения к окисляемому субстрату кислорода воздуха
Диоксигеназы (фермент, катализирующий гидроксилирование ароматического кольца фенилаланина)
Вопрос 6. Дегидрогеназы растений, их химическая природа и функции
Основная функция дегидрогеназ – активирование водорода в молекуле дыхательного субстрата и отделение его от окисляемого вещества, или дегидрирование.
В общем виде схема действия дегидрогеназ заключается в том, что активированный или лабильный водород дыхательного материала АН2 переносится на акцептор В, имеющий более высокую степень сродства к водороду:
АН2 + дегидрогеназа + В = А + ВН2 + дегидрогеназа
Дегидрогеназы делят на аэробные и анаэробные
1.Аэробные дегидрогеназы
*двухкомпонентные ферменты, куда наряду с белком в качестве простетической группы входит рибофлавин – производное витамина В2
*наиболее распространенные коферменты – ФАД и ФМН
*К аэробным дегидрогеназам относятся: лактатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа
*доноры электронов – анаэробные дегидрогеназы, акцепторы – цитохромы, кислород
2.Анаэробные дегидрогеназы
*Коферменты – НАД + и НАДФ + , коферменты имеют сходную структуру, за исключением того, что в НАДФ + на один остаток фосфорной кислоты больше; оба кофермента дают после гидролиза рибозу, аденин, никотинамид и фосфорную кислоту.
*В основе действия анаэробных дегидрогеназ лежит способность к обратимому дегидрированию и гидрированию пиримидинового ядра, входящего в состав коферментов этих дегидрогеназ в виде амида никотиновой кислоты
*К анаэробным дегидрогеназам относятся ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные превращения в процессах спиртового и молочнокослого брожения, например, алкогольдегидрогеназу, а также ферменты дегидрирования соединений, образующихся в процессе аэробного окисления ПВК (дегидрогеназы изолимонной, янтарной, яблочной кислот и др.)
*Переносят водород лишь на промежуточный переносчик.
Источник
Изучение ферментных систем дыхания
Из многих окислительно-восстановительных ферментов, вырабатываемых растениями, в данной работе исследуются только два:
1. Полифенолоксидаза — фермент, повышающий окислительный потенциал молекулярного кислорода, соединяя его с водородом, отщепляемым от полифенолов по схеме:
2. Пероксидаза — фермент, активизирующий кислород воздуха, окисляющий полифенолы и ароматические амины кислородом в присутствии перекиси водорода, например:
Обнаружить эти ферменты можно при помощи раствора гваяколовой смолы, которая при окислении активированным (атомарным) кислородом меняет свою окраску из коричневой в синюю. Работу удобно проводить на двух срезах исследуемой части растений, нанося на первый срез раствор гваяколовой смолы, а на второй — раствор гваяколовой смолы и перекись водорода. Посинение первого среза свидетельствует о присутствии в клетках полифенолоксидазы, тогда как посинение второго среза есть результат совместного действия двух ферментов: полифенолоксидазы и пероксидазы или в случае отсутствия в данном объекте первого фермента — одной пероксидазы.
Поместить на тарелку 2 куска исследуемого объекта и облить оба куска одновременно раствором гваяколовой смолы, причем второй срез дополнительно обработать каплей раствора перекиси водорода. Для контроля обработать таким же образом материал, предварительно подвергнутый кипячению. Исследовать несколько объектов, не допуская при этом попадания сока из одного объекта на срез другого.
Результаты занести в таблицу:
Можно ингибировать полифенолоксидазу хлоридами, посыпав поверх среза клубня NaCl или BaCl, KCl, CaCl и т.д. Пероксидаза хлоридами ингибируется в меньшей степени, поэтому при добавлении перекиси водорода на срез, где была нанесена соль и добавлена гваяколовая смола, посинение все же происходит, хотя и менее интенсивно.
В целом данная работа подтверждает теорию А.Н. Баха об активации ферментами-оксидазами О2 воздуха в заключительной стадии дыхания.
1) клубни картофеля, корнеплоды редьки, корни хрена и др.; 2) 1%-ный спиртовой раствор гваяколовой смолы; 3) 3%-ный раствор перекиси водорода; 4) тарелки; 5) скальпель.
Работа 4. Обнаружение редуцирующих ферментов при дыхании семян
10 пророщенных семян гороха очищают от кожуры и разделяют на семядоли. Половину всех семян помещают в колбочку с водой и кипятят в течение 3 минут, считая после закипания, чтобы убить ферменты. Затем обе порции семядолей помещают в две пробирки с раствором метиленовой синьки и оставляют на несколько минут до посинения поверхности семядолей.
Семядоли отмывают водопроводной водой и заливают дистиллированной водой в пробирке так, чтобы слой воды был выше семян на 2 см, помещают на водяную баню с температурой 30-35°С.
Через несколько минут наблюдают полное исчезновение синей окраски у семядолей, не подвергавшихся кипячению вследствие превращения метиленовой синьки в бесцветное лейкосоединение.
В данном опыте метиленовая синька выступает в роли акцептора водорода.
структурная формула восстановленная
метиленовой сини метиленовая синь
(окрашенная, базоформа) (бесцветная, лейкоформа)
Подобный эксперимент можно проводить с зелеными частями высших растений, например, с элодеей, пеларгонией, колеусом и др.
Здесь четко прослеживается взаимосвязь восстановительной активности с возрастом растения.
В практической агрономии этот метод используется для определения жизнеспособности семян и отдельных органов растений, где об этом свидетельствует степень окрашенности (интенсивность) семян метиленовой синью (метод Нелюбова).
1) спиртовка; 2) пробирки; 3) баня; 4) колбочки на 50 мл; 5) раствор метиленовой синьки; 6) семена гороха или фасоли.
Работа 5. Обнаружение дегидрогеназ при спиртовом брожении
В нормальных условиях спиртового брожения образовавшийся в процессе декарбоксилирования пировиноградной кислоты уксусный альдегид
СН3-СО-СООН СН3СОН + СО2
восстанавливается с помощью фермента алкогольдегидрогеназы и ее кофермента НАД·Н2 в спирт этанол:
СН3СОН + НАД·Н2 СН3СН2ОН + НАД
Если ввести второй акцептор водорода, например, метиленовую синь, то последняя, присоединяя водород, будет переходить в лейкосоединение и раствор обесцветится.
Убедиться в наличии дегидрогеназ при спиртовом брожении можно следующим образом. В колбу емкостью 100 мл внести 2 г прессованных дрожжей, прилить 20-30 мл 3%-ного сахара и хорошо взболтать. Затем прилить еще 40-50 мл раствора и снова взболтать. Взять 2 пробирки. Одну из них заполнить почти доверху раствором с дрожжами. Оставшийся раствор в колбе перекипятить в течение 3 минут, остудить и налить во вторую пробирку (контрольную). В обе пробирки внести 3-5 капель раствора метиленовой сини и закрыть ватными пробками. Поместить в водяную баню с температурой около 35°С.
Восстановление метиленовой сини в опытной пробирке начинается через несколько минут и вскоре раствор полностью обесцвечивается (20-25 минут). Раствор в контроле остается без изменения. Если, вынув ватную пробку из опытной пробирки, хорошо взболтать раствор либо продуть воздухом, то синяя окраска снова возвращается вследствие окисления кислородом воздуха образовавшегося лейкосоединения.
1) колбы на 50 мл; 2) 3%-ный раствор сахара; 3) прессованные или сухие дрожжи; 4) водяная баня; 5) пробирки; 6) спиртовка; 7) метиленовая синь; 8) ватные пробки.
Работа 6. Метод определения активности дегидрогеназ с помощью вакуум-инфильтрации (по Пыльневу)
В основу метода положена способность дегидрогеназ восстанавливать бесцветные соли тетразолия с образованием окрашенного формазана. Бесцветный ТТХ — 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид, присоединяя водород, восстанавливается до формазана красного цвета. Формазан нерастворим в воде, но хорошо растворяется в ацетоне или изопропиловом спирте. Метод позволяет работать с малыми навесками материала и выявлять активность дегидрогеназ как бесцветных (что удобнее), так и окрашенных пигментами биологических тканях.
При работе нужно выбирать однородный материал и разрезать крупные объекты на пластинки толщиной 1,5-2 мм. В маленькие бюксы берут навески по 30-100 мг предварительно разрезанного на пластинки растительного материала. Для навески заливают 5 мл раствора 2,3,5-трифенилтетразолия, приготовленного на буферной смеси; третью (контрольную) погружают в 5 мл чистой буферной смеси. Исследуемый материал сверху придавливают небольшим грузом (стеклянной пробкой) и помещают в вакуум-эксикатор, из которого масляным насосом выкачивают воздух, под давлением которого раствор начинает проникать в ткани. Бюксы закрывают крышками и переносят на 30 минут в термостат с температурой 31°С, где ткани приобретают красный цвет, интенсивность которого зависит от активности дегидрогеназ.
Затем каждую пробу вынимают из бюкса и тщательно растирают в ступке с небольшим количеством ацетона или изопропилового спирта. Содержимое ступки переносят в мерный цилиндр и доводят до 5-10 мл, в зависимости от интенсивности окраски. Остатки измельченной ткани должны полностью обесцветиться. После растирания все пробы центрифугируют в течение 3 минут при 1 500 оборотов в минуту и полученный окрашенный формазаном экстракт сразу колориметрируют на ФЭК при синем светофильтре. Если контрольная вытяжка зеленая, то чтобы снять цвет хлорофилла, колориметрируют при зеленом светофильтре. Активность дегидрогеназ вычисляют по разнице оптической плотности между показаниями ФЭК в опытных и контрольных пробах. Эта разница, выраженная в целых числах, названа индексом активности дегидрогеназ.
Результаты опыта записывают по следующей схеме:
Индекс активности дегидрогеназ
Источник