Гаплоидные растения in vitro

Получение гаплоидов

Большой интерес для селекционеров представляют гаплоидные растения. Гаплоиды получают двумя способами. Первый способ классический – отдаленная гибридизация, когда в зиготе отдаленного гибрида хромосомы одного из видов погибают. Второй способ основан на методиках культивирования in vitro, где из неоплодотворенных половых клеток с редуцированным набором хромосом можно регенерировать целые растения.

Обычно гаплоидные растения стерильны, так как у них нарушено формирование мужских и женских гамет. При культивировании in vitro, однако, может произойти спонтанное удвоение хромосом, или его можно вызвать искусственно, например, обработав колхицином клетки или растения. Дигаплоиды фертильны и вполне жизнеспособны.

Гаплоиды и дигаплоиды имеют ряд преимуществ в селекционной работе:

• Гаплоидные растения имеют один набор хромосом, характерный для гамет, что дает селекционерам возможность наблюдать мутации сразу же в ходе осмотра гаплоидных растений, поскольку все рецессивные генные мутации в гаплоидных организмах не маскируются доминантными аллелями.
• Если гаплоидные клетки подвергнуть полиплоидизации с помощью колхицина, то возникнут дигаплоиды, характеризующиеся абсолютной гомозиготностью. При размножении дигаплоидов не происходит расщепления, все признаки стабильно наследуются потомством. Скрещивание гомозиготных линий дает, как правило, высокопродуктивное потомство.
• Гомозиготные растения используются селекционерами и в других целях: количественный генетический анализ, изучение взаимодействия генов, изучение генетической изменчивости, определение групп сцепления, установление числа генов, действующих на количественные признаки, определение локализации полигенов и т.д.
• Гаплоидные растения лишены летальных или сублетальных мутаций, ведущих к гибели или ослаблению потомства.

Наиболее распространены следующие методы индуцирования гаплоидов:

• индуцированный андрогенез в культуре пыльников и пыльцы;
• селективная элиминация хромосом в гибридном зародыше. Этот метод чаще всего используется в селекции злаковых;
• псевдогамия — развитие гаплоидного зародыша после оплодотворения инородной пыльцой без оплодотворения яйцеклетки;
• гиногенез — развитие изолированной семяпочки.

В клеточной инженерии чаще применяется первый метод. Впервые гаплоидные растения были получены в 1964 году индийскими исследователями С. Гуха и С. Махешвари при культивировании пыльников дурмана. С тех пор таким методом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля и других культур. Для культуры пыльников используют целые пыльники, стерильно выделенные из бутонов в определенной фазе развития. Их помещают на твердую питательную среду, либо на поверхность жидкой питательной среды. В редких случая культивируют бутоны или соцветия.

Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников может идти по двум направлениям: прямая регенерация соматических зародышей и косвенная — через каллусогенез. В первом случае внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен формируются проэмбриональные структуры, которые при определенных условиях культивирования развиваются в эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям. Эмбриоиды — зародышеподобные структуры. Во втором — пыльца делится, но клетки, возникшие в результате делений, быстро увеличиваются в размерах и, разрывая оболочку пыльцевого зерна, образуют каллус. В результате дальнейшего морфогенеза из этих каллусных клеток регенерируют растения. При этом растения могут иметь разную степень плоидности — ди-, поли-, анеуплоидные. Последние часто стерильны, но после обработки растений колхицином происходит удвоение числа хромосом, в результате чего можно получить фертильные гомозиготы.

Культура пыльцы представляет собой культивирование микроспор, освобожденных от соматических тканей пыльника, в жидкой среде. Пыльцу от соматической ткани пыльника отделяют несколькими способами:

— Спонтанное высвобождение (пассивный способ) — пыльники определенным образом обрабатываются, инкубируются на жидкой среде, где лопаются, а пыльца высвобождается и всплывает наверх.

— Пыльники, культивируемые в жидкой среде, разрушают, надрезая скальпелем и осторожно выдавливая пыльцу, затем фильтруют (поры фильтра 50 -100 мкм) и центрифугируют. Осадок спор промывают и суспендируют в жидкой среде.

К недостатком метода андрогенеза относится высокая частота образования альбиносов – растений без хлорофилла.

При отдаленной гибридизации некоторых видов установлено явление селективной элиминации хромосом одного из родителей на ранней стадии развития гибридного зародыша. Это явление хорошо изучено у ячменя. При скрещивании диплоидных ячменей Hordeum vulgare (культурный) и H. bulbosum (многолетний луковичный дикий) на стадии роста зародыша и эндосперма (через 5 дней после оплодотворения) происходит выпад хромосом дикого вида. Возникает гаплоид с набором хромосом H. vulgare. Через 15 суток после оплодотворения рост гибридного зародыша на материнском растении прекращается, но при культивировании in vitro из таких зародышей развиваются проростки. Частота и количество образовавшихся растений при этом способе очень высоки. Кроме того, растения-альбиносы не образуются. С помощью этого метода были выведены сорта ячменя Исток и Одесский-115 – за 4 года вместо 10 — 12 лет обычной селекции, сорт моркови Соната. В Канаде так были получены сорта Минго и Родео.

Элиминация хромосом встречается и у других родов. Если в качестве опылителя использовать дикий ячмень, то можно индуцировать гаплоиды у ржи и пшеницы.

Работы по получению гаплоидов в культуре женского гаметофита начались в 50-е годы. В последнее время интерес к ним возрос. У растений с мужской стерильностью культивирование неоплодотворенных семяпочек является единственной возможностью получения гаплоидов. Женский гаметофит может быть источником получения гаплоидов и у растений с низким морфогенетическим потенциалом каллусной ткани, либо если каллусная ткань регенерирует растения-альбиносы. У некоторых растений, например у ячменя и риса, индукция зеленых растений намного выше при гиногенезе по сравнению с андрогенезом. Гиногенез может идти двумя путями – через эмбриогенез и через каллусогенез.

Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:

Источник

39. Получение гаплоидов и гомозиготных дигаплоидных линий методами in vitro

Получение гаплоидов дает большие возможности для технологий на основе культивируемых клеток растений. Гаплоидные клетки и растения позволяют легче обнаружить:

• рецессивные мутации,
• редкие рекомбинации,
• экспрессию введенного извне генетического материала.

Протопласты, полученные из гаплоидных клеток, после слияния образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Удвоение числа хромосом превращает гаплоид в фертильное гомозиготное диплоидное растение. Изогенные линии для получения гетерозисных гибридов на основе удвоенных гаплоидов можно создать в течение года (метод инбридинга требует для этого 4-6 лет). Такие изогенные линии на основе гаплоидов, полученных в F1 и F2 гибридных поколениях:

• облегчают селекционеру оценку и отбор нужных комбинаций признаков,
• позволяют в 2-3 раза ускорить процесс создания сорта для самоопыляющихся растений.

Гаплоиды могут возникать спонтанно в результате апомиксиса или партеногенеза, а также после обработки растений:

но выход спонтанных гаплоидов низок.

Получение гаплоидов методами культуры in vitro значительно легче. Источниками гаплоидных каллусных тканей или эмбриоидов являются микроспоры или клетки зародышевого мешка (соответственно при культивировании пыльников или семяпочек на питательных средах). При изолировании пыльника или семяпочки и культивировании их in vitro часть спор переходит к аномальному развитию, в результате которого из каллусов или эмбриоидов возникают растения.

Сейчас известны более 200 видов, для которых получены гаплоиды, в том числе представители семейств Пасленовые — Nicotiana, Solatium, l.ycoper-sicon, Злаковые, Крестоцветные и др.

Селекция посредством гаплоидных линий особенно развита в Китае, где методом культуры пыльников созданы новые высокоурожайные и устойчивые сорта риса (1976) и пшеницы (1978), возделываемые сейчас на площади 170 тыс. га и 70 тыс. га соответственно. В России созданы тысячи исходных линий риса, табака, пшеницы, ячменя и других культур.

В селекционной работе с ячменем разработан метод «бульбозум», основанный на элиминации хромосом у гибридного зародыша. Его суть заключается в том, что гибриды F1 или F2 ячменя скрещивают с определенными формами дикого ячменя Hordeum bulbosum. При оплодотворении яйцеклетки Н. vulgare пыльцой H. bulbosum образуется зигота, и при делении ее вследствие генетической несовместимости происходит элиминация отцовских хромосом, и начинает развиваться гаплоидный зародыш. Поскольку на материнском растении его нормальное развитие тормозится, его изолируют и выращивают in vitro. На уровне пробирочных растений отбраковывают гибридные проростки, а гаплоидные обрабатывают колхицином для удвоения числа хромосом и получения гомозиготных фертильных растений и изогенных линий.

В Канаде таким способом получены сорта ячменя Минго и Родео; в Одессе — сорт Одесский 15 (за 4 года вместо 10-12 лет). Подобный метод используют и при получении изогенных линий у пшеницы. У других злаков элиминация хромосом не происходит.

У картофеля и ряда других растений используют скрещивания, приводящие к псевдогамии — развитию гаплоидного зародыша из неоплодотворенной яйцеклетки после несовместимого опыления: S. tuberosum х S. phurjea; Medicago sativa х M.falcata; Triticum aestivum x Aegilops.

Источник