9. Культура каллусных тканей.
Культура изолированных тканейобычно бывает представлена каллусными или реже – опухолевыми тканями.
Каллусная культура– это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток, которые в дальнейшем специализируются как каллусные, т.е. становятся особым образом дифференцированными.Каллус («мозоль»)может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах)invitro, так и на растениях при поранении.
Оторванная от коллектива себе подобных клетка в пробирке сохраняет «память» — генетическую информацию, заложенную родителями. Но специализацию она утрачивает и образует при делении нечто аморфное, напоминающее по форме морскую губку – каллус– это ткань, которая возникает не только в пробирке, но и в естественных условиях при поранении растения. Помимо утраты узкой специализации клетка порой начинает вести себя, словно пациент сумасшедшего дома. Например, активные гены вдруг «застопориваются», а «спавшие» ни с того ни с сего начинают интенсивно работать. Клетка в «клетке», т.е. в пробирке, может резко изменить соотношение ферментных и структурных белков. В ней увеличивается число молекул РНК, синтезирующих в обилии те белки, к производству которых клетка ранее относилась с прохладцей, но стоит предоставить «узнице» определенные условия, как она вновь приобретает какую-то специализацию, причем не обязательно «старую»: взятая из корня или листа клетка образует целое растение. Регенерации полноценных растений из каллуса добиваются в принципе двумя путями: дифференциацией побегов и корней посредством изменения соотношения гормонов цитокинина и ауксина или образованием эмбриоидов. Этот соматический (асексуальный) эмбриогенез впервые был прослежен к 1959 г. у моркови; со временем его стали применять при производстве жизнеспособных растений у разных видов.
Каллусная ткань in vitroв основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивно зеленую окраску. Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов, которые затем окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты.
Каллусная ткань аморфнаи не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции:
1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие агрегаты;
2) среднейплотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
3) плотной, в которой дифференцированы элементы камбия.
9.2. Основные этапы формирования каллусной ткани.
Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие двух групп фитогормонов: ауксинов, вызывающих процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению и цитокининов, вызывающих пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток. Если в питательную среду, не содержащую этих гормонов, поместить растительный эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деления клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению.
Каждая клетка проходит 3 фазы роста:
Источник
Билет №14
6. Для многих микроорганизмов наилучшим субстратом, который поддерживает наиболее высокую скорость их роста является глюкоза, в клетке имеются специальные механизмы, направленные на первоочередное её усвоение. Для получения антибиотиков нужно знать зависимость скорости роста биомассы и накопления целевого продукта от концентрации субстрата в культуральной жидкости. Например, при биосинтезе тетрациклина с добавлением глюкозы происходит повышение количества антибиотика к концу ферментации в 5 — 7 раз по сравнению с нерегулируемым процессом при уменьшении продолжительности ферментации в 2 — 2.5 раза.
Глюкоза может влиять на утилизацию других субстратов, вызывая у микроорганизмов катаболитную репрессию. Она заключается в том. что глюкоза вызывает более или менее сильную, но постоянную репрессию катаболитических ферментов. Механизм катаболитной репрессии заключается в том. что глюкоза как- быстро ассимилируемый субстрата снижает внутриклеточную концентрацию циклического 3. 5 -аденозинмонофосфата (ц-АМФ) и вызывает накопление её в среде роста. Так. например, при процессе биосинтеза пенициллина на глюкозной среде очень малое накопление антибиотика при единовременной загрузке большого количества глюкозы вследствие эффекта катаболитной репрессии.
Дли -получений максимального количества целевого продукта 1 ‘несводимо в процессе ферментации непрерывное добавление глюкозы. Гак как степень интенсификации биосинтеза антибиотиков зависит от того, насколько близок к оптимальному выбранный режим дозирования субстрата.
Билет 15
2. Сравнительная характеристика каллусных и суспензионных культур растений.
Для накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений используют каллусные и суспензионные культуры, последние получают из каллусных.
Выход продуктов вторичного метаболизма выше в каллусных культурах.
Управление процессом культивирования легче осуществляется при работе с суспензионными кул ьту рами.
Отличие иммобилизованных клеток каллусной культуры от суспензионных культур:
Многократное использование биомассы: Четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма; Увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцировании:
Получение большого количества вторичных метаболитов.
Особенностью культивирования каллусных культур растений является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант. так и питательную среду.
Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар- боксе) стерильными инструментами.
Влажность в культуральной комнате должна состявлять 60-70%. Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей 25-26°С. Для того чтобы не произошло старение, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, первичный каллус, возникший на эксплантах, через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассивированием. При регулярном пассивировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.
Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо -Зч. свежей каллусной ткани.
Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивания среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани.
Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии ауксинов и цитокииинов. Обычно длительность пассажа составляет 14-16 дней.
Ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментёры, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.
Источник