Метод пцр анализа растений

М. Ю. ШПАК, магистрантка, О. В. ПОДДУБНАЯ, канд. с.-х. наук, доцент УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия», А. О. ПОДДУБНАЯ, студентка,

УО «Белорусский государственный университет»

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увели — чения малых концентраций определѐнных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо ампли — фикации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других мани — пуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицин — ской практике, например, для диагностики заболеваний (наследствен- ных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов и т. д.

Метод основан на многократном избирательном копировании оп- ределѐнного участка ДНК при помощи ферментов в искусственных

условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того уча — стка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том слу- чае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от ам — плификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более

3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определѐнных условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов.

ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем пе-риодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью

не менее 0,1°C. Современные амплификаторы позволяют задавать

сложные программы, и последующее хранение амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также при — боры с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что

позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Для выделения ДНК из растительной ткани можно использовать

коммерческий набор ―Genomic DNA purification kit‖ (Fermentas). Вы-

деление проводят в соответствии с методическими рекомендациями фирмы-производителя. Нарезку растительной ткани весом 50 мг (ли- стья или очищенные от чешуй почки) помещают в эппендорфы объѐ- мом 1 мл. Добавляют 200 мкл стерильной воды, растительную ткань гомогенизируют, к полученной смеси добавляют400 мкл Lysis solution, эппендорфы помещают в термостат и инкубируют в течении 50 минут при 65°C. Содержимое эппендорфов перемешивают переворачиванием каждые 10 минут. Сразу после нагревания, к содержимому эппендор — фов добавляют 600 мкл хлороформа, содержимое аккуратно переме — шивали переворачиванием (3-5 раз); эппендорфы центрифугируют при

10 000 оборотов/мин в течение 2 минут. Рабочий раствор Precipitation

solution готовят путѐм смешивания 720 мкл стерильной деионизиро-ванной воды с 80 мкл 10х-концентрированного раствора. Верхнюю

фазу после центрифугирования отбирают дозатором и переносят в эп — пендорфы, содержащие 800 мкл свежеприготовленного Precipitation solution. Аккуратно перемешивали переворачиванием в течение 1-2 минут и центрифугировали 14 минут при 10 000 оборотов/мин.

Супернатант сливают, осадок ДНК растворяют в 100 мкл 1,2 М NaCl аккуратным встряхиванием. В раствор добавляют 300 мкл холод — ного 90%-ного этанола, и оставляют на ночь. Затем смесь центрифуги — руют при 10 000 оборотов/мин в течение 14 минут. Сливают надоса-дочную жидкость и дают этанолу испариться. Промывают осадок в

70%-ном холодном этаноле. Растворяют осаждѐнную ДНК в 50 мкл

Hydration solution. Наличие ДНК в полученном растворе проверяют

при помощи электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Полученные

образцы ДНК хранят при +4С.

Для проведения ПЦР-анализа готовят стандартную смесь реакци-онных компонентов: 18,7 мкл milliQ воды, 2,5 мкл 10X Taq-буфера, 1,5

мкл 25 mM раствора MgCl2, 0,5 мкл 0,2 mM раствора dNTP, 0,5 мкл

праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы (1 ед.), 1 мкл ДНК-матрицы. Об-щий объем реакционной смеси составлял 25 мкл.

ПЦР-реакция проводится при следующих заданных параметрах:

35 циклов: 94С — 1 мин, 30С — 1 мин, 72С — 1,5 мин;

Продукты амплификации разделяют при помощи электрофореза в

1%-ном агарозном геле и 0,5 X TAE-буфере.

Результаты электрофореза анализируют с помощью аппаратного

обеспечения GelDoc (BioRad) и пакета программ QuantityOne-4.5.1

Методика идентификации с помощью ПЦР основана на выявлении

в исследуемом материале фрагмента ДНК (РНК), что обеспечивает

максимально высокую специфичность данного метода. ПЦР-

диагностика также является сравнительно новым методом исследова — ния организма на наличие каких-либо инфекций.

1. Глик, Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

2.Падутов, В. Е., Метод молекулярно-генетического анализа / В. Е. Падутов, О. Ю. Бара — нов, Е. В. Ворпаев. – Мн.: Юнипол, 2007. –176 с.

Материал взят из: Инновации в технологиях возделывания сельскохозяйственных культур – 2012: Материалы международной научно- практической конференции молодых ученых, аспирантов, магистрантов и студентов

Источник

Пресс-центр

Специалисты филиала ФГБУ «россельхозцентр» по Тульской области рекомендуют сельхозтоваропроизводителям для точной диагностики фитопатогенов применять метод ПЦР.
Сельскохозяйственные культуры повсеместно заражаются микроорганизмами: вироидами, вирусами, бактериями и грибами. Поскольку заболевания растений на практике не лечатся, главными средствами борьбы с ними являются создание устойчивых к тем или иным инфекциям сортов, своевременная профилактика и точная диагностика с целью выбраковки больного материала. Сегодня эффективной технологией установления наличия заболеваний считается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПЦР – диагностика (полимеразная цепная реакция) – высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций (фитопатогенов), основывается на исследовании генетического материала (ДНК и РНК).
Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий и вирусов. ПЦР анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами это сделать невозможно. Проведение испытаний с использованием метода амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР в режиме «реального времени») в растениеводческой продукции, это диагностика семенного картофеля на наличие бактериальной инфекции в скрытой форме, диагностика на наличие вирусной инфекции в скрытой форме, диагностика на наличие компонентов ГМО в семенах растений и посадочном материале, в сельскохозяйственных растениях и продуктах его переработки.
По вопросам использования метода ПЦР аграрии могут обращаться в филиал ФГБУ «Россельхозцентр» по Тульской области или в Куркинский районный отдел филиала.

Кем: Куркинский район Куркинский район Без тегов

Об информационном содержании вы можете написать администратору сайта. При перепечатке и ретрансляции материалов ссылка на сайт mvp.tularegion.ru обязательна. Информация персонального характера о пользователях cайта хранится и обрабатывается с соблюдением требований российского законодательства о персональных данных
Об использовании информации сайта

Для улучшения работы сайта и его взаимодействия с пользователями мы используем файлы cookie и сервис Яндекс.Метрика. Продолжая работу с сайтом, Вы даете разрешение на использование cookie-файлов и согласие на обработку данных сервисом Яндекс.Метрика. Вы всегда можете отключить файлы cookie в настройках Вашего браузера.

Источник