Методы диагностики вирусов растений

Серологические методы иммунодиагностики вирозов

Серологические методы иммунодиагностики вирозов – имммунодиагностические методы диагностики вирусных болезней растений и идентификации вирусов, основанные на иммуногенных и антигенных свойствах фитовирусов, позволяющие устанавливать вид вируса, генетические взаимодействия между вирусами, определять концентрацию и локализацию вируса в клетках и тканях инфицированного растения [1] .

В основе всех серологических реакций лежит специфическое взаимодействие антитела и антигена [2] .

Типы серологических реакций

Серологическими называют реакции иммунодиагностики вирозов и заболеваний других патогенных этиологий, для постановки которых используются сыворотки (serum), содержащие антитела (антисыворотки). В серологической реакции один ингредиент (компонент) всегда известен. Применяются такие реакции в двух случаях:

• для определения неизвестного антигена (вирус, бактерия, токсин) с помощью известного антитела (сыворотки);
• для определения антитела в сыворотке с помощью известного антигена[3] .

При диагностике фитопатогенных вирусов используют два типа серологических реакций:

1. Преципитации – образование специфического осадка при взаимодействии антител с антигеном, который представляет собой молекулы белка или полисахаридов. Если вирионы, определяемого вируса имеют палочковидную форму, то осадок рыхлый хлопьевидный, при изометрических вирионах – плотный зернистый [2][1] .
2. Агглютинации (склеивания) – проводятся с неочищенным соком растений, в котором вирионы адсорбированы на хлоропластах, обрывках клеточных стенок, митохондриях и других клеточных компонентах. Они вовлекаются в серологическую реакцию, образуя хорошо заметный осадок в виде сгустков – агглютинат [2][1] .

Методы серодиагностики

Разработано множество методов серодиагностики, основанных на вышеуказанных типах реакций, приведем примеры только некоторых:

1. Капельный метод – на стекло наносят каплю диагностической сыворотки и каплю нормальной сыворотки (без антигена). К каждой добавляют по капле сок исследуемых растений. Капли выдерживают во влажной камере при +22ºC в течение 4 минут. Нормальная сыворотка – контроль. Реакция положительная, если в капле с антисывороткой виден четкий осадок, отсутствующий в капле с нормальной сывороткой [1] .
2. Латекс-метод – основан на добавлении к антисыворотки полимерного соединения латекса. Оно адсорбируется на поверхности антител и способствует агглютинации при взаимодействии антиген – антитело и усиливает видимую реакцию. Чувствительность метода по сравнению с капельным возрастает в 100 и более раз. Техника такая же, как при капельном методе [2] .
3. Реакция преципитации в агаре по Ухтерлони – основана на различной скорости диффузии в агаре молекул антигена и антител. Агар высшей очистки тонким слоем наносят на стеклянные пластинки слоем около 3 мм. После застывания в слое агара вырезают лунки диаметром 5 мм: центральную и на расстоянии 1–1,5 см от нее 4–6 лунок. В центральной размещают антисыворотку, в остальных – вирусный препарат или сок исследуемого растения. Растворы антигена и антител диффундируют навстречу друг другу. При положительной реакции между центральной и периферическими лунками появляется дуга или прямая линии преципитации. Она хорошо видна в прозрачном агаре на темном фоне при боковом освещении [2] .
4. Нейтрализация инфекционности – вирус смешивают со специфической сывороткой, которая резко снижает его инфекционность без нарушения структуры. Метод используется при разделении вирусов в смешанных инфекциях. Кроме того, данный прием позволяет изучать серологическое родство между вирусами, передаваемыми только тлями[1] .

Источник

3. Методы диагностики вирусных болезней растений

В основе диагностики вирусного заболевания лежат в первую очередь внешние симптомы. Внешними признаками при определении вирусного заболевания можно ограничиться в тех случаях, когда они очень четки и характерны только для данного вида заболевания.

Пример такой конверген­ции — хлороз плодовых деревьев или ягодных культур. Он может быть инфекционным, вызванным вирусами, и физиологическим, связанным с недостаточным поступлением в растение азота, же­леза, серы и т. д. Мозаичная расцветка листьев на огурце может быть следствием и вирусного поражения и дефицита марганца.

Применяют следующие методы диагностики вирусных заболе­ваний и вызывающих их вирусов:

1) установление инфекцион­ного заболевания;

2) метод растений-индикаторов;

4) электронная микроскопия;

6) метод люминесцентного анализа;

Основными из них являются первые четыре метода.

Для всех вирусов, которые удается передать соком на травя­нистые индикаторы, очень важный показатель при диагностике — определение физических свойств вируса по установлению трех констант:

1. температура инактивации вируса (предельно высокая тем­пература, при которой вирус инактивируется invitro в течение 10 мин);
2. границы разведения (степень предельного разведения сока больного растения, при которой еще сохраняется его инфекционность);
3. длительность сохранения инфекционного сока.

1. МИКОПЛАЗМЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
2. ЦВЕТКОВЫЕ РАСТЕНИЯ
3. Повилики (Cuscuta)

Источник

Диагностика вирусных болезней растений

Диагностика вирусных болезней растений – это сочетание различных этапов и приемов определения вида вируса, являющегося причиной изучаемого заболевания [1] .

Успешная борьба с вирозами невозможна без своевременного выявления заболевания и правильно идентификации вида вируса. Диапазон технологий, используемых для обнаружения и идентификации вирусов чрезвычайно широк. Современные методы диагностики являются усовершенствованными или модифицированными общепринятыми фитопатологическими методами, а также заимствуются из смежных областей науки (молекулярной биологии, биохимии, иммунологии). Разработка новых методов обнаружения и идентификации вирусов – постоянно развивающийся, активный процесс [3] .

Первый этап диагностики – определение вида растения.

Основные методы диагностики вирозов

Диагностические приемы, используемые при идентификации вируса, во многом отличаются от приемов, применяемых при работе с патогенами грибной и бактериальной природы. Это объясняется морфологическими и биологическими особенностями вирусов: ультрамикроскопическими размерами, отсутствием способности к размножению на искусственных питательных средах, способность заражать растения разнообразных ботанических семейств, антигенная активность и прочее [1] .

К основным методам диагностики фитовирусов относят:

• визуальный метод диагностики вирозов;
• установление инфекционность заболевания;
• иммунодиагностика вирозов, в том числе серологический метод иммунодиагностики вирозов и иммуноферментный анализ вирозов;
• методы молекулярно-биологической диагностики вирозов, в том числе метод молекулярной гибридизации, метод полимерной цепной реакции с обратной транскрипцией;
• метод растений-индикаторов;
• электронная микроскопия;
• анатомо-цитологический метод;
• метод включений[2][1] .

Методы диагностики делят на прямые (электронная микроскопия, метод включений) и косвенные (метод растений-индикаторов, серологический, люминесцентный анализ) [1] .

Наиболее результативными в вирусологии являются: метод растений-индикаторов, метод электронной микроскопии, серологический, метод включений, установление инфекционности посредством переносчиков (для вирусов, не передающихся механическим путем). В последнее время широко используются молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция (ПРЦ) [1] .

Часто для более точной диагностики применяют комплекс методов [1] .

Этапы диагностики

Диагностика основывается на данных об основных свойствах вируса и в определенной мере на наблюдении за развитием заболевания [1] .

Для диагностики вирусных болезней растений предлагается использовать 10 этапов:

1. Определение вида зараженного растения [1] .
2. Изучение симптомов заболевания [1] .
3. Оценка распространенности заболевания, условий его развития и характера распределения [1] .
4. Изучение инфекционности путем инокуляции сока, передача векторами, прививкой или повиликой [1] .
5. Инокуляция или прививка серии растений-индикаторов с целью определения круга растений-хозяев вируса и его выделения [1] .
6. Определение сохранения инфекционности сока после хранения, разведения и прогревания при различных температурах в течении 10 минут [1] .
7. Исследования с помощью электронного микроскопа [1] .
8. Серологическое тестирование [1] .
9. Изоляция, очистка, определение физико-химических свойств, приготовление антисыворотки[1] .
10. Инокуляция здоровых растений того же вида[1] .

Источник