53. Получение и использование трансгенных растений для повышения продукции сельского хозяйства и качества продуктов питания
Трансгенными могут называться те виды растений, в которых успешно функционирует ген (или гены) пересаженные из других видов растений или животных. Делается это для того, чтобы растение реципиент получило новые удобные для человека свойства, повышенную устойчивость к вирусам, к гербицидам, к вредителям и болезням растений. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, могут иметь улучшенные вкусовые качества, лучше выглядеть и дольше храниться. Также часто такие растения дают более богатый и стабильный урожай, чем их природные аналоги.
Генетически измененный продукт — это когда выделенный в лаборатории ген одного организма пересаживается в клетку другого. Вот примеры из американской практики: чтобы помидоры и клубника были морозоустойчивее, им «вживляют» гены северных рыб; чтобы кукурузу не пожирали вредители, ей могут «привить» очень активный ген, полученный из яда змеи; чтобы скот быстрее набирал вес, ему вкалывают измененный гормон роста (но при этом молоко наполняется гормонами, вызывающими рак); чтобы соя не боялась гербицидов, в нее внедряют гены петунии, а также некоторых бактерий и вирусов. Соя — один из основных компонентов многих кормов для скота и почти 60% продуктов питания.
Получение трансгенных растений является на данный момент одной из перспективных и наиболее развивающихся направлений агропроизводства.
Существуют проблемы, которые не могут быть решены такими традиционными направлениями как селекция, кроме того, что на подобные разработки требуются годы, а иногда и десятилетия. Создание трансгенных растений, обладающих нужными свойствами, требует гораздо меньшего времени и позволяет получать растения с заданными хозяйственно ценными признаками, а также обладающих свойствами, не имеющими аналогов в природе. Примером последнего могут служить полученные методами генной инженерии сорта растений, обладающих повышенной устойчивостью к засухе.
Создание трансгенных растений в настоящее время развиваются по следующим направлениям: 1. Получение сортов с/х культур с более высокой урожайностью 2. Получение с/х культур, дающих несколько урожаев в год (например, в России существуют ремантантные сорта клубники, дающие два урожая за лето) 3. Создание сортов с/х культур, токсичных для некоторых видов вредителей (например, в России ведутся разработки, направленные на получение сортов картофеля, листья которого являются остро токсичными для колорадского жука и его личинок) 4. Создание сортов с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (например, были получены устойчивые к засухе трансгенные растения, имеющие в своем геноме ген скорпиона) 5. Создание сортов растений, способных синтезировать некоторые белки животного происхождения (например, в Китае получен сорт табака синтезирующий лактоферрин человека)
Таким образом, создание трансгенных растений позволяет решить целый комплекс проблем, как агротехнических и продовольственных, так и технологических, фармакологических и т.д. Кроме того, уходят в небытие пестициды и другие виды ядохимикатов, которые нарушали естественный баланс в локальных экосистемах и наносили невосполнимый ущерб окружающей среде. Создание конструкции для генетической трансформации растений 1) выделение либо синтез (химический, ПЦР) целевого гена (анализ его структуры, выделение кодирующей части, удаление ненужных частей); 2) присоединение к целевому гену регуляторной части – промотора;
Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор.
Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детёныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.
Трансформация-изменение генетических свойств клетки в резеультате проникновения в нее чужеродной ДНК.
Этапы получения трансгенных растений: 1 этап – выбор гена и его клонирование; 2 этап – подбор генотипа растения-реципиента; 3 этап – создание генной конструкции, содержащей выбранный ген и векторную молекулу-переносчик ДНК 4 этап – перенос векторной молекулы в геном растения с помощью наиболее приемлемого метода 5 этап – регенерация растений из трансформированных клеток и отбор трансгенных растений
Создание конструкции для генетической трансформации растений 1) выделение либо синтез (химический, ПЦР) целевого гена (анализ его структуры, выделение кодирующей части, удаление ненужных частей); 2) присоединение к целевому гену регуляторной части – промотора;
Методы трансформации растений
Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4-1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной хлоридом кальция или ПЭГ, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие сжатым воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300-600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, интегрируется в растительную ДНК. Частота трансформации повышается при использовании линейной, а не кольцевой ДНК. Баллистический метод позволяет встраивать нужные гены не только в хромосомы растений, но и в геном их органелл – пластид.
2) Конструирование векторных систем на основе Ti-плазмид
• гены биосинтеза ауксинов и цитокининов должны быть удалены, т.к. фитогормоны будут подавлять регенерацию из трансформированных клеток целого растения;
• ген опина также должен быть удален, т.к. при его наличии может снижаться биомасса;
• участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены, т.к. Ti-плазмида имеет очень большой размер;
• необходимо внести сайт инициации репликации, обеспечивающий их поддержание в E. Coli
3) Микроинъекция заключается в непосредственном введении растворов ДНК в клетку или ее ядро с помощью полых стеклянных микроигл. Клетка (протопалст) фиксируется на твердой поверхности. Под визуальным контролем на специальном микроскопе с помощью микроманипулятора производится введение микрокапилляра в ядро. С помощью специальной гидравлической системы через иглу подается от 1 до 5 пиколитров раствора ДНК с концентрацией от 0,1 до 1,0 мкг/мл.
• необходимость закрепеления клетки либо протопласта на поверхности стекла;
• трудоемкость и сложность используемого обрудования;
• наличие высококвалифицированного персонала, осуществляюшщего микроинъекцию.
Источник
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ
Регенерация трансгенного растения из неорганизованной массы делящихся генетически транформированных клеток.
Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют «трансгенами») из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов.
Наиболее широко используемый метод трансформации — агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли — корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку.
Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.
Признаки, которые возможно придать с помощью генной инженерии, весьма разнообразны и в основном ограничены только наличием соответствующих генов. Очень условно их можно разделить на три группы. К первой относятся признаки, интересные производителям: устойчивость к различным факторам окружающей среды — гербицидам, болезням, вредителям, засухе, засолению, улучшение минерального питания, повышение укореняемости. Вторая группа признаков представляет интерес непосредственно для потребителей — модификация вкуса и аромата плодов, увеличение продолжительности их хранения, изменение окраски цветков, бессемянность, улучшение питательной ценности растений. В третью группу входят растения-«биофабрики», способные синтезировать вакцины, ферменты, биополимеры и другие полезные вещества.
ДНК бактерий существуют не только в виде хромосом, но и в виде маленьких кольцевых молекул (плазмид). Бактерии Agrobacterium tumefaciens помимо прочих содержат плазмиды, вызывающие опухоли (Ti-плазмиды). На такой плазмиде среди прочих генов имеется так называемая область Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухоли на растениях и синтез опинов. Именно этот кусочек плазмиды агробактерии встраивают в ДНК растений. Выяснилось, что агробактерии в принципе способны переносить в растения любую ДНК, которая расположена в этом месте плазмиды. Поэтому в плазмидах, используемых в генно-инженерных целях, природные гены заменяют любыми другими, представляющими интерес для человека. Как правило, это два-три гена: целевой, который придает, например, устойчивость к насекомым; селективный, который придает устойчивость к определенным веществам (чаще всего — антибиотикам), что позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как нетрансформированные клетки в ней гибнут; и иногда — репортерный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например, по окрашиванию или свечению в ультрафиолетов ом свете.
В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых проще всего регенерировать целые растения (чаще всего используются листья). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерии с помощью vir-белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в растительную ДНК.
Затем растительную ткань помещают на питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерии перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам, то есть трансформированные. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (калллус), из которой регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом — на полях и в теплицах.
Создание одного нового сорта ГМР стоит от 50 до 300 млн долларов и занимает от 6 до 12 лет.
Источник