Вопрос № 6. Микроклональное размножение растений.
В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Оба эти способа имеют как свои преимущества, так и недостатки.
К недостаткам семенного размножения относятся генетическая пестрота семенного материала и длительность ювенильного периода.
При вегетативном размножении генотип материнского растения сохраняется, а также сокращается длительность ювенильного периода. Однако большинство видов плохо размножается вегетативным способом, к ним относятся многие древесные породы. Например, эффективность размножения, даже на ювенильной стадии, дуба, сосны, ели, орехоплодных не очень высока. Кроме того, с помощью черенкования невозможно размножать многие виды древесных растений в возрасте старше 10-15 лет. Трудно получить стандартный посадочный материал, так как существует возможность накопления и передачи инфекции. Операции по размножению с помощью прививок сложны и трудоемки.
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения. Клональное микроразмножение — получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. Термин «клон» был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon — черенок или побег, пригодный для размножения растений). В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
- получение генетически однородного посадочного материала;
- освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
- высокий коэффициент размножения (10 5 — 10 6 — для травянистых, цветочных растений, 10 4 — 10 5 — для кустарниковых древесных растений и 10 4 — для хвойных);
- сокращение продолжительности селекционного процесса;
- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
- возможность проведения работ в течение всего года;
- возможность автоматизации процесса выращивания.
Источник
5.Этапы микроклонального размножения растений in vitro.
1)выбор раст-й донора, взятие экспланта (часть органа / ткани раст-й, выращ-й на пит среде / использ-ся для получ калуса) и изолирование экспланта, его стерилизация и введение в культуру in vitro.
2)МКР in vitro через калус бок. побегами, эмбриойдами.
3)Укоренение побегов подращ-я и накопление растений (хранение t 2-10°).
4)Пеесадка раст-й в субстрат / почву, адаптация к внешним условиям (in vivo — внутри клети??). Высадка в теплицу, реализация.
6.Экспланты
Экспланты- часть органа или такни, для культивирования in vitro или получения каллуса.
Выбор экспланта зависит от: вида раст-я, времени года, фазы развития растений и развития органов из к-х взят эксплант
Эксплантами могут быть: меристемы, часть листа, цветоложе, тычинки, лепестки, часть стебля.
Корни сложно стерилизовать из-за наличия микоризы. А видоизмененные побеги можно брать.
Хорошо перевод-ся в культуру in vitro 2400 видов культивир в фазу актив-го роста. Но лилии Весной/осенью, летом плохо. Тюльпаны в период покоя (как листья засохнут их выкапывают).
Для грубых Э стерилизац р-ром сулимы (выдержка 5-10 мин), для нежных гипохлорит натрия NaCIO и Гипохлорит кальция ca(clo)2конц 5-9 % 5-15 мин. Для уничтож эпифитной микрофлоры.
Самое вложное при введение культуры в ин витро — стерильность. Можно стерил антибиотиками.
Обычно на питательные среды высаживают небольшую часть меристемы до 0,5 мм. В целом закономерность такова: чем меньше величина меристемы, тем больше вероятность получения безвирусных растений.
Культивирование растений из апикальных меристем позволяет получать безвирусный оздоровленный посадочный материал практически всех сельскохозяйственных культур.
Получение микрочеренков
Использование микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение. В качестве черенков чаще всего используются просыпающиеся почки или верхушки молодых побегов.
7) Методы стерилизации эксплантов.
В период акт роста утром берут Э с раст-й (верхушки побегов) -> лаб -> укорач-т, облам-т листья -> склад в марлевый мешочек -> этикетка -> промывка в мешочке 2 часа -> 20 мин в тёпл воде + перемешивание с добавл-м ПАВ
Экспланты подвергают стерилизации. Берут мешочек, на нем этикетка. Сначала промывают водой 2 часа, встряхивают 20 минут, затем растворяют ядовитые вещества р-р сулимы HgCl2 – 0,1 % 5-7 мин, NaClO и Ca(Cl0)2 – 5-7% 10-15 минут, промывают водой стерильной 3-5 раз, затем вычлиняют меристемы, если оздорав от вируса, то 0,1-0,3 мм, если просто размнож-е 1-2 мм. -> помещают в пробирку со средой Мурасига-Скуга. В ламинарном боксе высушивают на питательную среду, применяют антибиотики.
8) Питательные среды и условия выращивания растений in vitro.
Питательная среда Мурасига-Скуга вводят макро – микроэлементы, витамины В1 В6 С РР, тиамин, пиридоксин, фолиевая кислота, хлористый кальций, хелат железа, глицин, 6-БАП, глюкоза, также вносят агар для застывания среды.
1)высокие дозы АУК в среде вызыв образ-е калуса
2)при соотноше УИК к кинетину 1:1-10 из калуса образ-ся стебли
3)при УИК к кинетину 1:100, 1:10 образ-ся КС
Все работы по микроклональному размножению проводят асептически в ламинарном боксе, в котором дует ветер 0,4 м/с. Включают продувку за 30 минут. Рядом на столе готовят стерильную чашку Петри, 2 салфетки, пит среду, бумажные колпачки, поддоны, штативы. Вымыть руки спиртом, сесть в бокс и принять салфетки, протереть салфеткой стол, чашку Петри, инструменты (пинцет и ножик), питательную среду.
Большинство растений выращ при t 20-25°, для троп 30, лук / нарциссы / тюльпаны 18.
Источник