Лаборатория «Микрокосмос»
При изготовлении постоянных препаратов для микроскопического анализа тканей растений важная роль отводится комбинированной окраске. Она позволяет на одном препарате выявить различные ткани для более детального изучения их анатомических особенностей. Окраска основана на разном сродстве тех или иных клеточных структур к различным красителям [Барыкина и др., 2004]. Так, лигнифицированные клеточные оболочки, имеющие кислую реакцию, хорошо окрашиваются основными красителями, а нелигнифицированные клеточные оболочки – кислотными.
Как правило, комбинированная окраска тканей растений двуцветная, получаемая с помощью двух контрастных по цвету красителей. Наиболее применимы следующие пары красителей: сафранин и водный синий (Прозина, 1960), сафранин и водный зелёный (Прозина, 1960), карболовый фуксин и пикроиндигокармин (Аксенов, 1967), алциановый синий и сафранин (D. a. J. Tolivia, 1987) и т.п. Наиболее известна и проста в применении комбинированная окраска по Этцольду [ Etzold , 1983]. Это смесь трёх красителей в 2%-й уксусной кислоте: основной фуксин (1:10 000), сафранин (1:2500), водный синий (1:1000). В 2002 году Этцольд модифицировал свой метод окраски и предложил заменить сафранин хризоидином [ Etzold , 2002]. Эта смесь также проста в применении, долго хранится.
С публикацией Робином Уокером нового метода полихромной окраски тканей растений для световой и флюоресцентной микроскопии [ Wacker , 2006], вновь возрос интерес к применению акридиновых красителей в ботанической микротехнике. Уокер предложил использовать для окраски срезов растительных объектов следующие растворы красителей: акридиновый красный (1% раствор в 50% этаноле), акрифлавин (1% раствор в дистиллированной воде), астра-синий (1% раствор в дистиллированной воде). Акридиновый красный и акрифлавин являются также флюорохромами. Достоинством этого нового метода является насыщенность окраски клеток с лигнифицированными оболочками и возможность наблюдения препаратов с помощью люминесцентного осветителя. Сложность применения этого метода для многих исследователей состоит в поэтапном применении трёх красителей и необходимой дифференциации окраски. Метод был рекомендован для окраски объектов, прошедших проводку и заливку в парафин. Как известно, для процесса проводки, пропитки, заливки и резки на микротоме необходима специализированная лаборатория с дорогостоящим оборудованием. Кроме того, для депарафинизации срезов необходимо использование вредного для организма ксилола.
Весной 2011 года мы приняли решение модифицировать метод Уокера, провели серию экспериментов по приготовлению постоянных препаратов. Основной целью работы являлось упрощение нового метода полихромной окраски. Эти красители мы смешивали — смесь №1.
Кроме рекомендуемых Уокером красителей (акридиновый красный, акрифлавин, астра-синий), мы часто в полихромной окраске тканей используем четвёртый краситель — хризоидин, хорошо окрашивающий в оранжевый цвет кутикулу или другие красители. Также мы иногда для полихромной окраски тканей растений используем другие комбинации красителей: №2 (альциановый синий, родамин B, акрифлавин); № 3 (альциановый синий, акридиновый красный, акрифлавин); №4 (астра-синий, сафранин, хризоидин, толуидиновый синий), №5 (сафранин, альциановый синий) и др.
Михальцов А.И. разработал несколько авторских смесей красителей для полихромной окраски тканей растений: Mikhaltsov FSA, Mikhaltsov CRA, Mikhaltsov FRA (см. фото). Это готовые смеси, содержащие три красителя. Такие смеси хорошо использовать не только для научных целей, но и для занятий со студентами, школьниками.
.JPG)
Приготовление препаратов – это целый ряд последовательных этапов, количество которых зависит от поставленных задач, в том числе, какие вы готовите препараты — временные или постоянные. В данном случае, я уделю внимание изготовлению постоянных препаратов, но БЕЗ проводки, пропитки и заливки в парафин, изготовления парафиновых блоков и т.п. Примеры изготовления постоянных препаратов приведу на научной работе обучающихся в нашей исследовательской лаборатории «Микрокосмос». Все фотографии выполнены нами.
И так, считаем, что вы подготовили рабочее оборудование, красители и др. Приведём пример с использованием красителей, предложенных Робином Уокером, но метод модифицирован нами в начале 2011 года и опубликованный в 2012 году (Михальцов, 2012).
Материалы, оборудование.
Фиксированный или свежий растительный материал.
Реагенты.
Готовые красители: акридиновый красный (Acridinrot), акрифлавин (Acriflavin), астра-синий (Astrablau), толуидиновый синий (Toluidinblau), альциановый зелёный (Alciangruen), хризоидин (Chrysoidin), сафранин (Safranin), альциановый синий (Alcianblue) и др. Дистиллированная вода, этиловый спирт разной концентрации (70%, 50%, 30%), изопропиловый спирт 99, 7%, формалин (40%), ледяная уксусная кислота (99.5%), монтирующая среда Euparal.
Оборудование: микроскопы, ручной цилиндрический микротом или салазочный, одноразовые лезвия для микротомов, держатель одноразовых лезвий, часовые стёкла, чашки Петри, предметные и покровные стёкла, кисточки, препаровальные иглы, нагревательный столик, песочные часы, пинцеты, держатели, спиртовка, пипетки, термостат, блоки из стиропора, корнеплодов моркови.
Основные этапы приготовления препаратов:
1. Выбор объекта и его подготовка: сбор, нарезка, фиксация.
Выбраны объекты: либо это стебли, либо листья, либо рахисы папоротников и т.д.
Есть два способа заготовки материала:
1) Нарезать кусочки стеблей, черешков длиной около 2 см и сразу поместить их в фиксатор на 5-7 суток.
2) Отрезать кусочки стеблей, листьев перед самой процедурой резки на микротоме, а затем тонкие поперечные срезы поместить в фиксатор.
Рекомендуемый фиксатор – FAA: этиловый спирт 70% — 100 мл.; формалин – 7 мл., ледяная уксусная кислота – 7 мл. Материал в этом фиксаторе можно держать до недели, а затем промыть этиловым спиртом и поместить 70%-й этиловый спирт.
На фото 3-4 показано как мы храним заранее фиксированный летом материал:
Источник
Микротом
Микротом — это устройство для изготовления тонких гистологических срезов тканей животных и растений. Микротом состоит из подвижного столика, в котором закреплен объект, и микротомного ножа. В некоторых микротомах столик с объектом каждый раз поднимается на заданную высоту, равную толщине среза, а нож перемещается в горизонтальной плоскости, рассекая ткань. Иногда нож укреплен неподвижно, а перемещается по вертикали столик с объектом, каждый раз надвигаясь на лезвие ножа.
Рис. 1. Санный микротом: 1 — микрометрический винт; 2 — перекидной механизм подачи; 3 — винт, фиксирующий стержень основания объектодержателя; 4 — стержень основания объектодержателя.
Санные микротомы (рис. 1) используют для получения срезов тканей, предварительно заключенных в парафин или целлоидин. Основные части санного микротома: станина, механизм микроподачи, механизм подъема, объектные салазки с зажимом для ткани, суппорт с ножедержателем. Для получения срезов нефиксированной ткани, а также в случаях, когда необходимо изучить объект в короткий промежуток времени, используют замораживающие микротомы (рис.2), снабженные замораживающим столиком, на котором укрепляется исследуемый объект. Столик гибким шлангом соединен с металлическим баллоном, в котором находится жидкая углекислота. Для замораживания тканевых блоков применяют также термоэлектрический охлаждающий столик (ТОС-1) с селеновым выпрямителем: электрический прибор, корпус которого имеет рабочую охлаждающую поверхность и штуцеры для подведения воды и электрического тока.
Рис. 2. Замораживающий микротом.
Микротом следует содержать в чистоте и регулярно смазывать трущиеся поверхности (направляющие станины, резьбовая часть микровинта, направляющая и трущиеся поверхности механизма подъема) вазелиновым маслом. Для приготовления сверхтонких срезов, пригодных для исследования под электронным микроскопом, применяют ультрамикротомы.
Наибольшее распространение в последнее время получили ультрамикротомы, состоящие из стального стержня, на одном конце которого укреплен объект, зажатый в держателе, а другой связан с основанием прибора ленточной пружиной. Стержень свободно перемещается вверх и вниз, что осуществляется посредством электромотора, вал которого связан со стержнем. При опускании стержня объект проходит мимо ножа (стеклянного, алмазного) и срез оказывается на поверхности жидкости ванночки, прикрепленной к ножу. Точность возвращения ножа в исходное положение равна ±10 Å.
Микротом (от греч. mikros — малый и tome — разрезание, отсечение) — прибор для изготовления гистологических срезов. Среди существующих моделей микротомов наиболее распространены санные, радиальные и ротационные (рис. 1—4). Основными частями микротома являются: массивная станина (корпус), подающий механизм с микрометрическим винтом, держатель объекта (или столик) и держатель микротомного ножа.
Рис. 1. Радиальный микротом со столиком для замораживания объекта. 
Рис. 2. Ротационный микротом с лентой для приемки серийных срезов. 
Рис. 3. Санный микротом (общий вид) 
Рис. 4. Схема устройства большого санного микротома с наклонной плоскостью: а — вид сбоку; б — вид сверху; 1 — станина; 2 — шайба с делениями для неавтоматической подачи объекта; 3 — полозья для скольжения объектодержателя; 4 — шпиндель микрометра; 5 — сток для капельной ванны; 6 — капельная ванна; 7 — штанга для полуавтоматической подачи объекта; 8 — держатель объекта; 9 — держатель ножа; 10 — нож; 11 — блок ножа; 12 — полозья для скольжения блока.
В санных микротомах (рис. 3 и 4) в верхней части станины расположены шлифованные плоскости, по которым скользит массивный подвижный суппорт. В суппорте закреплен держатель ножа, снабженный устройством, которое позволяет установить нож либо поперечно к направлению его движения (для замороженных и парафиновых срезов), либо косо (для целлоидиновых срезов), а также изменять угол наклона ножа. При отведении ножа назад до отказа включается полуавтоматический подающий механизм, поднимающий держатель объекта (столик) на заданное количество микронов.
Держатель объекта снабжается винтами, позволяющими закрепить блок в нужном положении по отношению к плоскости движения ножа. Микрометрический винт подающего механизма в большинстве современных моделей устанавливается в наклонной плоскости, но выпускаются и модели с вертикальным расположением винта.
Реже в санных микротомах нож устанавливается неподвижно, а по шлифованным плоскостям передвигается объект с держателем.
В радиальных микротомах (рис. 1) держатель ножа закреплен у одного из его концов и регулировке поддается лишь угол наклона ножа. Подающий механизм с вертикальной установкой микрометрического винта включается, как и в санных микротомах, при отведении ручки от себя. Микротомы этих двух типов обычно имеют устройство, позволяющее заменять держатель объекта для залитых в парафин или целлоидин кусочков специальным столиком для получения замороженных жидким углекислым газом срезов. Радиальные микротомы не всегда позволяют получить достаточно тонкие срезы из залитого в парафин и особенно в целлоидин материала. Чаще эти микротомы применяют для получения замороженных срезов; нередко их называют «замораживающими микротомами».
Ротационный микротом (рис. 2) имеет неподвижный нож, горизонтально закрепленный лезвием вверх. Держатель объекта передвигается вверх и вниз путем вращения колеса рукой или мотором. Специальный механизм выдвигает держатель объекта при каждом его поднятии на заданное количество микронов. Срезы один за другим сползают с ножа на специальную ленту, движущуюся синхронно с держателем. Этот тип микротома особенно удобен для получения серийных срезов с залитого в парафин материала.
Названные типы микротомов позволяют получать срезы не тоньше 1 мк (обычно 5—15 мк). Для получения более тонких срезов, например для работы с электронным микроскопом, служат ультратомы и ультрамикротомы (см.).
См. также Гистологическая техника.
-
- Анатомический атлас
- Физиология человека
- Детские болезни
- Йога
- Правильное питание
- Как похудеть
- ЛФК (лечебная физкультура)
- Лучшие курорты мира
- Лечение народными средствами
- Лекарственные растения
- Проктология
- Психиатрия
- Алкоголизм
- Курение
- Спортивная медицина
- Судебная медицина
Источник