Молекулярно генетический анализ растений
Калаев В.Н. 2 Землянухина О.А. 1 Карпеченко И.Ю. 1 Карпеченко К.А. 1 Кондратьева А.М. 1 Вепринцев В.Н. 2 Карпеченко Н.А. 2 Карпова С.С. 2 Моисеева Е.В. 2 Баранова Т.В. 2
В статье приведены результаты исследования по использованию молекулярно-генетического анализа на основе ПЦР с использованием шести RAPD-праймеров. Исследование проводилось на 8 видах представителей рода Rhododendron L. с целью выявления индивидуальных спектров ампликонов и дальнейшей паспортизации. Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировалось в зависимости от праймера от 16 (праймер Oligo 2) до 18 (праймер Oligo 4, Oligo 6, Oligo 1), а их размеры – от 170 до 2800 п.н. В среднем, при RAPD-анализе у видов рода рододендрон один праймер инициировал синтез 18,16 фрагмента ДНК. Общее количество локусов амплификации для каждого праймера по 8 видам составило 104. На основе полученных данных было определено процентное сходство в структуре ДНК представителей разных видов. Показано, что данный вид ПЦР анализа является весьма информативным при паспортизации рододендронов, но, безусловно, результаты данной работы необходимо подкреплять другими видами молекулярно-генетических исследований.
1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. – М.: Мир, 1994. – Т. 1. – С. 520.
2. Баранов О.Ю., Каган Д.И. Микросателлитный анализ берёзы повислой // Молекулярная и прикладная генетика. – 2005. – Т. 1. – С. 157.
3. Боронникова С.В., Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Дрибноходова О.П., Тихомирова Н.Н. // Генетика. – 2007. – Т.43, №5. – С. 653–659.
4. Ковалевич О.А., Каган Д.И. Изменчивость митохондриальной ДНК дуба черешчатого на территории Белоруссии // Наука о лесе XXI века: материалы международной научно-практической конференции. – Гомель, 2010. –
6. Стегний В.Н., Чудинова Ю.В., Салина Е.А. RAPD-анализ разнопродуктивных сортов и гибридов льна культурного // Генетика. – 2000. – Т. 36, № 10. – С. 1370–1373.
7. Созинова Л.Ф., Цветков И.Л., Комаров А.Б. Разработка протокола генетической дифференциации сортов пшеницы с использованием нового класса молекулярно-генетических маркеров // Биотехнология. Теория и прак-
8. Цветков И.А., Иванов А.Н., Глазко В.И. Генетическая дифференциация сортов риса по IRAP-маркерам // Известия ТСХА. – 2006. – № 4. – С. 155–159.
9. Chalmer K.J., Waugh R., Sprent J.I., Simons A.J., Powell W. Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G. maculata using RAPD markers // Heredity. – 1992. – Vol. 69. – P. 465–172.
10. Lanying Zh., Yongqing W., Li Zh. Genetic diversity and relationship of Rhododendron species based on RAPD analysis // American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci. – 2008. – Vol. 3 (4). – P. 626–631.
Род рододендрон (Rhododendron L.) семейства Вересковые (Ericaceae) насчитывает около тысячи видов вечнозеленых, полулистопадных и листопадных кустарников и деревьев. Кроме того, среди чистых видов встречается большое количество естественных гибридов, а селекционерами создаются гибриды и сорта, несущие признаки, характерные для различных видов. Это создает определенные трудности для определения видовой принадлежности и систематического положения представителей данного рода [5, 10]. В настоящее время в систематике для определения видов наряду с морфологическими и анатомическими признаками используются и данные биохимических и генетических исследований, хотя доля последних все еще несоизмеримо мала [10]. Неоспоримая ценность такого подхода обусловлена требованиями современной науки к разработке естественной классификации, отражающей не только формовое разнообразие, но и эволюционно-таксономические взаимоотношения видов внутри рода Rhododendron.
Генетическая паспортизация представляет собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью морфологических или молекулярных маркеров. Описание морфологических характеристик селекционного материала — элемент классического генетического анализа и селекционного скрининга, его можно считать первым этапом генетической паспортизации [4]. Второй этап связан с разработкой и использованием биохимических и молекулярно-генетических маркеров.
На сегодняшний день проведение генетической паспортизации считается актуальной задачей современной селекции. В мировой практике для паспортизации пород и индивидуальной паспортизации объектов лесного и сельского хозяйства используют преимущественно ДНК-маркеры. Это ядерные элементы, в основном микросателлиты, так называемые STR-маркеры или последовательности ДНК, ограниченные инвертированными повторами.
Молекулярно-генетический анализ имеет ряд существенных преимуществ перед морфофизиологическим. Применение данного метода является актуальным для:
1) оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений, с учетом показателей генетического разнообразия, установленных по результатам молекулярного маркирования множественных геномных участков, а также с обязательным учетом уровней внутри- и межпопуляционного разнообразия;
2) сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений с возможностью проведения отбора в природных условиях популяций и их групп как с наиболее типичными, так и со специфичными характеристиками генофондов;
3) молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений необходима для оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне, позволяющая на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК составить молекулярно-генетическую формулу, штрих-код популяций и обобщить данные в виде генетического паспорта [4].
Среди молекулярных маркеров, имеющих множественную локализацию в геноме, наиболее распространёнными являются RAPD-маркеры (RAPD-ПЦР — случайно амплифицированная полиморфная ДНК). Методика ПЦР позволяет амплифицировать ДНК из любой части генома, в том числе фрагменты ДНК с неизвестной (анонимной) нуклеотидной последовательностью [11].
Цель исследования. В рамках комплексного подхода к решению проблемы систематизации представителей рода Rhododendron начата работа, целью которой стало молекулярно-генетическое маркирование с использованием RAPD-метода коллекции рододендронов Ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служили свежие листья 8 видов растений рода рододендрон: Rh. smirnovii, Rh. catawbiense, Rh. brachycarpum, Rh. quinquefolium, Rh. albrechtii, Rh. japonicum,
Rh. dauricum, Rh. thomsonii.
Начальным этапом данного исследования явилось получение препаратов нуклеиновых кислот (ДНК). Как оказалось, при выделении ДНК из разных объектов необходимо учитывать их физиологические и биохимические особенности и, в соответствии с полученными данными, адаптировать уже известные методы выделения ДНК путем внесения в них необходимых модификаций.
Выделение ДНК проводили по модифицированной методике с использованием в качестве детергента ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид). Качество и количество полученных препаратов определяли спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-102, а также при помощи электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
Реакцию ПЦР проводили с использованием RAPD-праймеров (декануклеотидные праймеры к инвертированным повторам) в амплификаторе «Терцик» в течение 2 часов. Для ПЦР была использована реакционная смесь следующего состава: 2,5 мкл 10*ПЦР буфера (100 мМ Трис-НCl; рН 8,8; 500 мМ КСl), 25 мМ MgCl2, смесь 10 мМ нуклеотидтрифосфатов, 10 мМ праймера, 1 ед. Taq ДНК-полимераза и 1 мкл ДНК (20 нг/мкл).
Для ПЦР применялись следующие RAPD-праймеры: Oligo 1, Oligo 2, Oligo 4, Oligo 6, Oligo 12 и Oligo 29. Температуру отжига для каждого из праймеров подбирали в компьютерной программе OLIGO 6. На следующем этапе выполняли электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 2% агарозном геле с 1х ТАЕ-буфером при 120 Вт в течение 2 ч, длина пробега 5-7 см. Готовый гель окрашивали бромистым этидием, фрагменты ДНК анализировали в трансиллюминаторе Vilber Lourmat. Размеры полученных ампликонов определяли с использованием программного обеспечения Gel Imager-2.
Результаты исследования и их обсуждение
Для выявления индивидуальных различий в структуре ДНК и составления их генетических паспортов для каждого вида рододендронов была проведена ПЦР с каждым из 6 RAPD-праймеров, которые фланкировали участки ДНК, ограниченные инвертированными повторами. На основании полученных спектров ампликонов были составлены таблицы, отражающие наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного для каждого из праймеров (наличие ампликона обозначалось цифрой 1, отсутствие цифрой 0) (табл. 1-6).
Наличие или отсутствие соответствующего ампликона, характерного
для праймера Oligo 2, у восьми видов рододендронов
Источник