Морфогенез растений in vitro

1. Ozyigit I.I., Gozukirmizi N., Semiz B.D. Genotype dependent callus induction and shoot regeneration in sunflower (Helianthus annus L.) // African Journal of Biotechnology. – 2007. – Vol. 6 (13). – P. 1498–1502.

На современном этапе развития селекции растений важное значение приобретают методы получения растений-регенерантов в культуре клеток и тканей in vitro. Способность клеток и тканей к росту и развитию in vitro определяется генотипом растения-донора и условиями культивирования.

Целью исследования являлось изучение влияния консистенции питательной среды и генетических факторов (гены l, la, o, pa) на морфогенез подсолнечника in vitro.

В качестве изучаемого материала использовали набор модельных линий, несущих аллели генов l, la, o, pa, контролирующих нестандартную окраску язычковых цветков подсолнечника, созданных в генофоне линии ЮВ-28Б, служившей в проводимых экспериментах стандартом. Незрелые зародыши помещали на жидкую или с содержанием агара 8 г/л питательную среду Мурасиге-Скуга и с добавлением гидролизата казеина 400 мг/л, фитогормонов 6-бензилоаминопурина (6БАП) 4 мг/л и нафтилуксусной кислоты (НУК) 2 мг/л. Экспланты, высаженные на питательные среды, культивировали в темноте при температуре 25 °C.

Для регенерации использовали питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 6-бензилоаминопурина (6БАП) 0,5 мг/л, гидролизата казеина 500 мг/л и инозита 100 мг/л. Пробирки с новообразованиями помещали на свет и культивировали при температуре 25 °C. Полученные данные обрабатывали методом двухфакторного дисперсионного анализа.

Морфогенез клеток растений in vitro может происходить различными путями – от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. Регенерация растений in vitro может осуществляться прямым или непрямым органогенезом либо соматическим эмбриогенезом (Ozyigit I.I. at all., 2007). В наших исследованиях наблюдалось несколько путей морфогенеза: каллусогенез, прямой органогенез и соматический эмбриогенез из клеток каллуса.

Анализ экспериментальных данных показал, что на жидкой среде клетки активно делились без дифференциации и формировалась масса каллусных клеток неокрашенных и активно пролиферирующих. На твёрдой среде с агаром преимущественно наблюдалась прямая регенерация побегов из клеток эксплантов, при этом каллус образовывался плотный и меньшего объёма. Рыхлые, оводнённые каллусы со временем подвергались некрозу. На морфогенных каллусах формировались плотные молочного цвета зоны меристематической активности, которые после пассирования окрашивались и формировали от 1 до 12 почек.

В ряде случаев после нескольких пассирований на части побегов наблюдалось образование одной или нескольких корзинок, что негативно сказывается на конечной регенерации растений. Подобное развитие побегов также отмечали и другие исследователи (Ozyigit I.I. at all., 2007).

Двухфакторный дисперсионный анализ данных показал, что достоверные различия наблюдались между генотипами и при взаимодействии факторов «генотип-среда». У всех генотипов наблюдалось преимущество каллусогенеза на жидкой среде и усиление регенерации на твёрдой среде. По данным ряда авторов увеличение концентрации агара в среде в целом повышает уровень диференциации клеток и регенерации побегов, а использование жидкой среды активизирует процесс каллусогенеза.

Анализ полученных на 28 сутки культивирования новообразований показал, что каллус образовывался с различных частотой. В среднем за три года все изучаемые линии, несущие аллели генов l, la, o, pa, по показателю «индукция каллуса» достоверно превышали линию-стандарт ЮВ-28Б. Только у трех линий, несущих аллели генов pa, la, l на твердой питательной среде частота регенерации почек, листьев и побегов достоверно превышали стандарт.

Отсюда следует, что каллусы формировались у всех линий не зависимо от содержания в питательной среде агара, при этом введение в генофон линии ЮВ-28Б генов l, la, o, pa повышало эффективность каллусогенеза. Регенерация почек и побегов существенно зависела от генотипа линий. Обнаружен достоверный положительный эффект на этот показатель только трех аллелей генов pa, la и l.

Таким образом, на жидкой питательной среде клетки экспланта преимущественно делились без дифференциации и формировалась каллусная ткань, которая стимулировала каллусогенез, а на твердой питательной среде преимущественно наблюдалась прямая регенерация. Использование маркерных генов pa, la и l оказывали положительное влияние на процессы каллусогенеза и регенерации подсолнечника in vitro, в то время как ген о не оказал существенного влияния.

Источник

ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН

Морфогенетический потенциал растительной клетки проявляется в системах in vitro в более широком диапазоне, чем в природных условиях, благодаря эволюционно обусловленной у сосудистых растений способности к регенерации. Дан обзор работ по индукции морфогенеза с помощью экзогенных регуляторов и путем генетической трансформации генами rol. К главным условиям, необходимым для индукции программ регенерации, относятся нарушение целостности и создание асимметрии. В опытах in vitro эти условия достигаются повреждением, экстрадицией экспланта, разнообразными физическими, прежде всего, субоптимальными температурными воздействиями, изменением освещенности и добавлением в питательную среду физиологически активных соединений (гормональных добавок и антитубулиновых агентов). В зависимости от сочетания внутренних и внешних факторов, определяющих начальные условия, возможны разные морфогенетические сценарии, что порождает трудности регуляции морфогенеза в системах in vitro. Предложено описание процесса морфогенеза в терминах теории множеств на базе концепции биологических референтов. Проведенная формализация выявила принципиальные различия в начальных стадиях индивидуального развития в условиях in vitro и in vivo, а также позволила сравнить их с достижениями в изучении регуляции морфогенеза у позвоночных животных. В результате такого сравнения сформулирована концепция двух языков, ответственных за события морфогенеза у многоклеточных организмов. Первый из них связан с событиями дифференциации, которые определяются спецификой транскрипции структурных генов хроматина, что можно формально представить как ряд последовательных состояний генотипа, каждое из которых отображается в фенотипе. Второй язык не имеет фенотипического выражения, он относится к правилам получения и хранения информации, которая здесь понимается как некоторая базовая структура ДНК индивидуума и особое состояние хроматина, неактивное в отношении транскрипции. Дана интерпретация формальных диаграмм индивидуального развития у растений с позиции представлений о молекулярных механизмах регуляции морфогенеза. Приводится схема состояний генотипа, соответствующих разным уровням дифференциации.

Источник