46. Получение культуры каллусных клеток.
Каллусная культура – это неорганизованная профилирующая(делящаяся) ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся таким образом дифференцированными. Каллус может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при поражении.
Эксплант — фрагмент ткани или органа, используемый для получения первичного каллуса. Лучшими эксплантами для получения каллуса являются: — молодая ткань; -ткань ответственная за пролиферацию (меристема).
Нежелательно использовать: — одревесневшие ткани; — старые ткани с низким уровнем метаболизма; — плохо пролиферирующие ткани (напр., мякоть плодов); -ткани, покрытые восками, суберином.
На поверхности органов растений всегда находится эпифитная микрофлора. Эксплант должен быть освобожден от всех видов микроорганизмов (бактерий, грибов, микоплазм и т.д.). Поверхностная стерилизация освобождает эксплант от наружной инфекции.
ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА:
1) Предварительная стерилизация (проводят очистку поверхности путем ее промывания проточной водой; обработки этанолом (70%-ный раствор в течение 1 мин), растворами CuSO4 либо KMnO4)
2) Стерилизация (в условиях ламинар-бокса предварительно простерилизованные ткани помещают в стерилизующий раствор)
3) Постстерилизация (растительный материал отмывают от стерилизующего агента 3-4 порциями стерильной дистиллированной воды)
4) Перенос стерильных эксплантов на питательную среду
5) Получение первичного каллуса – При оптимально подобранной среде первичные каллусы в количестве достаточном для пересадки образуются в течение 3-8 недель в зависимости от вида растения.
6) Субкультивирование (пассирование) – Первичный каллус разделяют на части, которые в дальнейшем культивируются отдельно. Следует обратить внимание на размеры трансплантов, переносимых на свежую питательную среду: если они слишком малы, то дальнейший рост каллуса может быть угнетен.
Основным условием превращения растений клетки в каллусную является присутствие в питательной среде фитогормонов.
Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, приготавливающие её к делению, а цитокинины – пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток.
Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без верхушки) или любой другой эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деление клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется.
Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению. Каждая клетка имеет три фазы роста: 1) деление; 2) растяжение; 3) дифференцировку. Характерной чертой заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того, чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки как в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной ткани в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки.
Источник
Занятие 9.
ТЕМА ЗАНЯТИЯ:Технология культивирования растительных клеток. Каллусные и суспензионные культуры. Методы получения и контроля культур.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:Рассмотреть теоретические основы культивирования растительных клеток и тканей. Ознакомиться с особенностями получения каллусных и суспензионных культур.
Вопросы, выносимые на семинар:
- Охарактеризуйте понятие «культура растительных тканей».
- Перечислите преимущества использования растительных клеток в биотехнологии.
- Охарактеризуйте направления развития клеточной биотехнологии.
- Поясните значение свойства тотипотентности клеток для их практического использования.
- Охарактеризуйте этапы технологической схемы получения культуры растительных клеток.
- Введите понятие «эксплант». Укажите основные этапы подготовки экспланта для культивирования.
- Охарактеризуйте особенности технологии приготовления питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей. Рассмотрите роль ингредиентов, входящих в состав питательной среды, для получения культуры растительных клеток.
- Охарактеризуйте условия, которые необходимо соблюдать при культивировании изолированных клеток и тканей растений.
- Введите понятия «каллусная культура» и «каллус». Приведите характеристику культуры каллусных тканей. Рассмотрите этапы формирования каллусной культуры. Поясните особенности кривой роста каллусной культуры.
- Рассмотрите свойства каллусных клеток: общие с нормальными клетками и свойства, характерные только для каллусных клеток.
- Охарактеризуйте особенности генетики каллусных клеток. Перечислите причины генетической нестабильности культивируемых растительных клеток.
- Охарактеризуйте особенности клеточных суспензий. Рассмотрите технику получения клеточных суспензий. Укажите роль клеточных суспензий в практическом аспекте. Перечислите и поясните основные характеристики клеточных суспензий.
- Введите понятие культуры одиночных клеток. Введите понятие «клон». Поясните трудности культивирования одиночных клеток и методы их устранения.
- Дайте определение понятий «протопласт», «культура протопластов». Поясните особенности технологии получения протопластов. Приведите примеры.
- Охарактеризуйте особенности меристематической культуры.
Учебный материал.
- Понятие культуры растительных тканей.
- Историческая справка и общая характеристика роли клеточной инженерии в развитии биотехнологии.
- Свойства растений, используемые в биотехнологии.
- Историческая справка.
- Значение клеточной инженерии.
- независимость от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, погода, почвенные условия, вредители);
- более высокий выход и качество продукта благодаря оптимизации и стандартизации условий выращивания;
- экономия посевных площадей;
- растения – источник многих экономически важных веществ, но запасы растительного сырья в природе постепенно истощаются, следовательно, нетрудно представить место клеточной технологии в будущем.
- Основные направления развития клеточной инженерии.
- Двудольные травянистые.
- Однодольные травянистые.
- Зерновые культуры.
- Голосемянные.
- отрезков стебля и корней;
- изолированных фрагментов паренхимы тканей клубня;
- сердцевины стебля;
- мезофилла листа;
- органов цветка (завязи, пыльцы)
- наращивание первичного каллуса;
- субкультивирование – перенос трансплантана свежую питательную среду. В оптимальных условиях осуществляется через 3-4 недели.
- культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;
- завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи котоҏыҳ или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца.
Источник
Получение каллусных культур растений
19. Культуры соматических клеток растений. Этапы каллусогенеза. Методы культивирования клеток и тканей растений
В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.
Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток. Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора.
Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань — один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поражения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа.
Основные этапы получения каллусных культур
Выбор экспланта.
Каллусы двудольных растений могут быть легко получены из:
Каллусы однодольных растений обычно получают из:
Подбор питательной среды, условий культивирования.
Стерилизация растительного материала:
Изоляция эксплантов (минимальный критический размер экспланта). Перенос стерильных эксплантов на питательную среду.
Герметизация
Культивирование:
Отбор каллуса:
Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro можно разделить на 2 группы:
Она ведет к самому, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений. Оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение м/у выбранными парами в естественных условиях. Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами:
Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш не ᴨпереходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению.
Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосᴨерма.
Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны.
Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.
Криосохранение растений. Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (темᴨература — 196° С) — новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда.
Клеточная селекция растений: сомаклональная вариабельность. Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, сегодня находит все большее применение и при создании новых биотехнологий Клеточные изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие. С разработкой техники получения растений-регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений.
Селекция растений на клеточном уровне. Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с получением сомаклонов. Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для с/х – возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками.
Источник