Препараты культуры тканей растений

Биотехнологическое получение лекарственных средств на основе растительных клеточных культур.

Термин «культура клеток, органов, тканей» применяется к выращиваемым в асептических условиях на искусственных питательных средах различным частям растений. К ним относят:

1. Каллусные ткани на агарированной среде;

2. Суспензионные культуры клеток в жидкой среде;

4. Изолированные органы растений, позволяющие получать от одной меристемы сотни тысяч побегов.

История метода клеточных культур растений. Методики и подходы.

Работы по изолированию культур, когда зародыши вычленялись из семени и выращивались в искусственных условиях, принадлежат Блоцишевскому (1876), Брауну и Моррису (1892), Боннэ и Саксу (1893). В 1902 г. Г. Габерланд научился культивировать отдельные клетки в течение некоторого времени и выдвинул гипотезу о тотипотентности (свойство клетки реализовать генетическую информацию, обеспечивающую её дифференцировку и развитие до целого организма), которая впоследствии была подтверждена экспериментально.

В монографии «Культура растительных тканей» (1949) Филипп Уайт выделяет несколько периодов в истории развития метода культуры клеток, тканей и органов растений:

1. 1834 -1900 гг. — создание и разработка клеточной теории.

2. 1900 –1922 гг. — сформулирована идея культуры тканей.

3. 1922 – 34 гг. — безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное культивирование тканей.

4. 1934 — 39 гг. — детальная разработка техники культуры растительных тканей.

Период 1940 — 1960 гг. значительно расширил список видов растений, выращиваемых in vitro. В 1960 — 1975 гг. положено начало методу получения изолированных протопластов и разработаны методы получения безвирусных растений из меристематических тканей (Р.Г. Бутенко, Ю.Ю. Глеба). Начались эксперименты по созданию установок для глубинного культивирования клеток. Начиная с 1976 г., разрабатывались методы электрослияния протопластов и селекции гибридных клеток, культивирования гаплоидных клеток и получения новых форм и сортов сельскохозяйственных растений, создание системы иммобилизованных клеток для получения различных химических соединений и их биотрансформации. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.

Первичные и вторичные метаболиты, их характеристика.

Проблемы синтеза вторичных метаболитов.

Растения с давних времен использовали не только в качестве источника питания, но и как поставщиков широкого набора химических соединений, включая лекарственные препараты, инсектициды, пищевые добавки, отдушки и красители. Даже в настоящее время при успешном развитии микробиологических и химических способов производства растения еще остаются источником тех соединений, производство которых еще слишком сложно, или дорого. Чаще всего основной интерес представляют продукты вторичного метаболизма растений. К веществам вторичного синтеза относят: алколоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др.

На выход вторичных продуктов в культурах растений клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологические и генетические регуляции синтеза вторичных метаболитов. Знание этих закономерностей позволяет регулировать процессы получения ценных веществ.

Источник

7. Использование культуры растительных тканей для получения стероидных соединений.

На основе культур растительных тканей было выделено более 50 различных стероидных соединений: -ситостерин, стигмастерин, диосгенин, холестерин, тигогенин, гитогенин, 24-метиленхолестерин и другие.

Виды диоскореи интенсивно изучаются в культуре ткани в качестве возможных продуцентов стероидных сапонинов. Диосгенин, представляющий интерес в качестве исходного вещества для производства гормональных препаратов, выделен из культур тканей видов Dioscorea, D. deltoidea, D. tokoro, D. composita, D. floribunda, Solanum xanthocarpum, S. laciniatum и другие. Содержание диосгенина в культурах тканей в зависимости от происхождения и условий культивирования растений различно: 1,33 % в культурах клубневого происхождения D. floribunda; 3,8 % в культуре ткани D. Deltoidea, росшей в хемостате.

В настоящее время наметился переход к промышленным способам культивирования тканей D. Deltoidea. Скорость роста культуры D. deltoidea в ферментере достигла 0,55 г/л в день, максимальная продуктивность по содержанию диосгенина – 12 мг на 1 л культуральной среды за один день в случае двухстадийного процесса (7,8 % от массы сухой ткани).

В сумме сапонины, выделенные из каллусных тканей D. deltoidea, обладали фармакологической активностью, аналогичной активности стероидных сапонинов из интактного растения.

Работы ученых с культурами тканей, продуцирующими стероидные соединения, внесли большой вклад в изучение биосинтеза этих соединений. Используя меченые предшественники ( 14 С-ацетат, 14 С-мевалоновую кислоту, 14 С-2,3-оксидосквален, 4- 14 С-холестерин и другие соединения) было установлено, что ключевым предшественником сапонинов является циклоартенол, а также то, что гидроксилированию кольца А в биосинтезе йоногенина и токорогенина предшествует гидроксилирование боковой цепочки холестерина.

В результате комплекса таких исследований предложена следующая последовательность биосинтеза стероидных сапонинов: мевалонат–циклоартенол–холестерин–3, 16, 26–тригидроксихолест–5–ен–3, 16, 22, 26–тетрагидроксихолест–5–ен–диосгенин (йоногенин) – токорогенин.

Задание 2. Выполнить лабораторную работу.

Вариант 1. Биотрансформация лекарственных веществ в организме.

1. Качественная реакция на дезоксикортикостерон-ацетат (лекарственный препарат).

Принцип метода. Реакция основана на взаимодействии дезокортикостерон-ацетата с серной кислотой с образованием продукта с образованием продукта синего цвета с красной флюоресценцией. Техника выполнения работы. К 1 капле дезоксикортикостерон-ацетата добавить 4 – 5 капель 96 % спирта и 4 – 5 капель раствора концентрированной серной кислоты. Нагреть до закипания. Появляется синее окрашивание.

1. Обнаружение 17-кетостероидов в моче (продуктов окисления стероидных гормонов).

Принцип метода. Метод основан на взаимодействии 17-кортикостероидов с м-динитробензолом в щелочной среде с образованием продуктов конденсации розово-фиолетового цвета. Техника выполнения работы. К 4 – 5 каплям мочи добавить 4 – 5 капель 2 % раствора м-динитробензола в спирте и 2 – 3 капли концентрированного раствора гидроксида калия. Появляется розово-фиолетовое окрашивание. Вариант 2. Биотрансформация органических субстратов ферментативными системами культивируемых тканей растений. Целью проводимого исследования является:

1. Ознакомление с основными типами реакций биотрансформации, катализируемых монооксигеназными системами животных, растительных и микробных клеток.
2. Освоение метода определения n-анилингидроксилазной активности культуры ткани женьшеня.

Принцип метода. Метод определения n-анилингидроксилазной активности основан на определении образующегося n-аминофенола. Реакция протекает на молекуле цитохрома Р-450 только в присутствии молекулярного кислорода и НАДФН + , являющихся необходимыми кофакторами процесса микросомального окисления. n-аминофенол реагирует с фенолом и в присутствии карбоната натрия образует окрашенный в синий цвет индофенольный комплекс. Практическая значимость работы.

1. На примере n-гидроксилирования анилина показано, что культуры тканей растений могут быть использованы не только в биосинтезе вторичных метаболитов de novo, но и для биотрансформации химических соединений.
2. Способность культивируемых тканей растений может быть использована в биотехнологических синтезах фармацевтических препаратов (стероидов, алкалоидов, гликозидов и других).
3. Путем селекции или с помощью методов генетической инженерии можно создавать линии клеток с более высокой трансформирующей способностью.

Техника выполнения работы. Навеску ткани (1,0 г) тщательно растирают в ступке с 1 мл буфера с целью гомогенизации. Гомогенат центрифугируют при 15000 об/мин. Надосадочная жидкость представляет собой экстракт ткани, свободный от митохондрий, ядер и обломков клеток. Схема проведения опыта.

Вариант	Состав инкубационной смеси, мл
	0,04 М трис-HCl буфер, рН 7,4	0,16 М MgCl2	0,03 М НАДФН +	Экстракт культуры ткани	0,03 М анилин
Опыт	1,5	0,1	0,1	0,2	0,1
Контроль	1,6	0,1	0,2	0,1

Инкубацию проводят при 37 С в течение 15 минут. Реакцию останавливают добавлением 1 мл 10 % раствора ТХУ. После осаждения белков смесь фильтруют, отбирают 1 мл фильтрата и определяют содержание в нем n-аминофенола путем добавления 0,5 мл 10 % раствора карбоната натрия и 1,5 мл 2 % фенола в 0,2 М растворе гидроксида натрия. Для развития окраски пробы выдерживают на водяной бане при 37 С в течение 10 минут. Оптическую плотность опытной пробы против контрольной измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете 10 мм при 670 нм. Величину n-анилингидроксилазной активности рассчитывают по формуле: С*1,5*30 , г ткани где С – концентрация n-аминофенола, найденная по калибровочному графику; 1,5 – расчетный коэффициент численно равный объему экстракта, полученному из 1,0 г ткани; 30 – разведение пробы. Литература:

1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. В.П. Комов, В.Н. Шведова, Н.В. Кириллова, О.М. Спасенкова, В.И. Фирсова, Л.А. Троицкая. – СПб.: СПХФА. – 1998.
2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.
3. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.
4. К практическим занятиям по биологической химии: Методические указания/ Под ред. В.И. Закревского. – Волгоград: ВМА. – 1999.
5. Лекционный материал по биотехнологии.
6. Микробиология продуцентов биологически активных соединений: Методические указания к лабораторным занятиям/ Сост. С.В. Гурина, Т.С. Потехина, Н.Н. Елинова. – СПб.: СПХФА. – 1997.

7. Николаева Л.А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование: Текст лекций. – СПб.: СПХФИ. – 1992. 8. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987. 9. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с. 10. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002. Темы рефератов. 1. Проблемы биотрансформации стероидных структур. 2. Структура промышленного биотехнологического производства стероидных гормонов. 3. Подходы к решению проблемы селективности процессов биоконверсии. 4. Микробиологический синтез гидрокортизона. 5. Получение стероидных соединений на основе культур растительныхклеток. 6. Перспективы осуществления процессов биоконверсии стероидных соединений с применением технологии иммобилизованных ферментов.

Источник