Сохранение генофонда высших растений

46. Криосохранение генофонда и его техника

Криосохранение – один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Оно позволяет хранить органы, ткани и клетки в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-196°С). Хранимый в этих условиях материал остается генетически стабильным и не подвержен изменениям, которые происходят с организмами при хранении обычными способами.

Развитие криобиологии (науки о действии низких температур на живые организмы) началось в 1900 году, когда К. Линде и Дж. Дьюар получили в значительных количествах жидкий воздух, состоящий из азота и водорода. Выдерживаемые в нём бактерии в дальнейшем не только оживали, но и сохраняли свои свойства.

Основными критическими моментами криосохранения являются образование льда внутри и вне клеток организма и их дегидратация (обезвоживание).

Образование внеклеточного и внутриклеточного льда заключается в том, что снижение температуры окружающей среды ниже точки замерзания раствора приводит к его переохлаждению, образованию льда вокруг клеток и возникновению центров кристаллизации. Вода выходит из клеток и замерзает на поверхности внешнего льда.

Образование внутриклеточного льда обычно повреждает клетки, и только в случае формирования очень мелких (стеклообразных) кристаллов льда они могут дальше развиваться.

Клетки растений являются более трудным объектом для криоконсервации, чем клетки животных. Это связано с их более крупными размерами: размер растительной клетки 15-1000 мкм, а размер клеток животных 7-25 мкм. Кроме того, растительные клетки содержат специальные органоиды – прочную целлюлозную стенку. Особенно осложняет обезвоживание наличие системы вакуолей. Центральная вакуоль в клетках растений может занимать до 90% от их общего объёма, что затрудняет их обезвоживание.

Технология криосохранения базируется на закономерности, что при криосохранении (криоконсервации) клетки переходят в состояние глубокого анабиоза и после длительного пребывания в нем возвращаются в обычное (нормальное) состояние.

Основные этапы криосохранения.

1. Предварительное культивирование клеток или организмов. При этом учитывают устойчивость их к воздействию состава среды культивирования, а также соответствие возраста, стадии роста и количества клеток перед извлечением.
2. Расфасовка подготовленного материала в контейнеры. При этом для замораживания и хранения подготовленных клеток или организмов используют разнообразные типы контейнеров. Расфасовку проводят в стерильных условиях.

Более совершенным методом хранения генофонда является криосохранение (в жидком азоте), где полностью прекращаются все метаболические процессы. Он гарантирует стабильное сохранение генетических характеристик объектов в течение практически любого срока. Его можно применять для сохранения генофонда широкого диапазона объектов — от изолированных протопластов до зародышей и семян.

В настоящее время метод замораживания и хранения разработан не более чем для 60 видов растений. Так, в криобанке Института физиологии растений РАИ хранятся в жидком азоте культивируемые клетки ряда линий и мутантов различных растений, в том числе уже более 20 лет культура моркови. Сотрудниками этого института совместно с ПИИ картофельного хозяйства разработаны методы криосохранения меристем многих сортов картофеля. В среднем из 20 % хранящихся меристем регенерируют растения, которые при высадке в поле по всем признакам не отличаются от обычных пробирочных растений.

Наиболее проста техника криосохранения пыльцы. Подсушенную пыльцу помещают в полиэтиленовые ампулы и прямо переносят в пеналы, находящиеся в сосуде Дьюара с жидким азотом. У 5 сортов картофеля пыльца, размороженная после 1, 2 и 3 лет хранения, имела высокую жизнеспособность, фертильность и была эффективно использована при скрещивании.

Более сложной является технология криосохранения культивируемых клеток, меристем, кончиков побегов, зародышей, так как необходимо защитить замораживаемые клетки и ткани от осмотического стресса и механического разрушения структур кристаллами льда, а также обеспечить жизнеспособность при опаивании и рекультивации. Глубокое замораживание — хранение — оттаивание являются экстремальным воздействием.

Технология включает следующие этапы:

• подготовка культуры (специальное предварительное культивирование),
• добавление криопротектора,
• программное замораживание,
• хранение в жидком азоте,
• быстрое оттаивание,
• удаление криопротектора,
• рекультивирование и регенерация растений.

Криопротекторы — это вещества, которые при замораживании должны уменьшить повреждения клеток от осмотического и механического стрессов. Криопротекторами служат:

• диметилсульфоксид,
• глицерин,
• поливинилпирролидон,
• полиэтиленгликоль,
• декстран и др.

Предобработка клеток осмотически активными веществами (маннитом, сорбитом, пролином и другими аминокислотами) также помогает защитить их от стрессов, повышая выживаемость после глубокого замораживания и оттаивания.

Режим замораживаиия на этапе от 0 до -40 °С может быть медленным (0,5-1,0 °С/мин) или сверхбыстрым (непосредственное погружение в жидкий азот объекта размером до 0,5 мм). При этом замораживание в медленном режиме дает более успешные результаты, но требует специального оборудования (программный замораживатель).

Оттаивание и восстановление роста культур часто представляет собой критический этап процесса. Для ряда видов разработаны свои методики, включающие определенную скорость, температуру и другие характеристики. Уже сейчас криобанки могут облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов и диких видов. При этом можно сохранить без генетических изменений уникальные гибридные, мутантные и трансформированные линии.

Источник

Сохранение генофонда высших растений в коллекциях и криобанках.

Сохранение разнообразия форм жизни – важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Ещё Г. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнообразия – единственный механизм стабильности жизни на Земле. Существует несколько способов сохранения генофонда высших растений: заповедники, национальные парки, банки семян. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т. е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196°С). Криосохранение имеет существенные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико-химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде.

3. Сомаклональная вариабельность.

Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако четко можно выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от генетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования invitro, а также от генотипа и исходного экспланта.Цитологические исследования показали, что вариабельность, индуцируемая условиями культивирования invitro, связана с генетическими изменениями. Прежде всего одним из основных источников появления фенотипических вариантов являются различные кариологические изменения и перестройки. Однако выявить, какие из них будут иметь фенотипический эффект и наследоваться как стабильная мутация генов, часто сложно. Как грубые, так и тонкие хромосомные изменения – мелкие деления, дупликации, транслокации, инверсии – могут вызвать существенные фенотипические изменения как в растениях-регенерантах, так и в последующем потомстве. Сомаклональную изменчивость можно проследить на молекулярном уровне, оценивая тонкие перестройки ядерной ДНК

Дата добавления: 2018-02-18 ; просмотров: 887 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

29. Основные методы сохранения генофонда

Генофонд того или иного вида представляет совокупность генов сла­гающих его особей. Т. Добжанский (1951) определяет генофонд как общую сумму различных генов в популяции, где индивидуальные гены имеют из­вестную частоту. М.Е. Лобашев (1969) указывает, что все особи вида име­ют общие характерные черты, а также свои индивидуальные генотипические различия, что в целом отражает генетическое разнообразие, которое называют «генофондом» вида. Вид у растений представляет собой сложную систему более мелких подразделений (подвидов, климатипов, экотипов и популяций), отражающую его генетическую дифференциацию. Основной формой существования вида является популяция. Поэтому тео­ретической основой изучения генофонда вида для последующего исполь­зования в практике лесного хозяйства и селекции является исследование популяционной структуры вида и внутри видов о и изменчивости.

В процессе развития человечества наши леса, как и остальные компо­ненты природы, подвергаются значительным изменениям. Так, в течение многих столетий выборочные рубки деревьев лучшего качества без заботы об их восстановлении в целом отрицательно влияют на лесонасаждения. Это приводит к обеднению мирового генофонда лесных древесных популяций.

Изменения современного мирового генофонда древесных пород под влиянием отрицательной селекции в лесоводстве побудили к созданию при департаменте лесного хозяйства ФАО отдела лесных ресурсов, а также экспертного совета по лесным генным ресурсам. Подобная группа органи­зована также при Международном союзе лесных исследовательских орга­низаций для разработки мероприятий по сохранению мировых естествен­ных генных ресурсов.

Обследование генофонда древесных растений в настоящее время проводится путем изучения генетической структуры популяций основных лесообразователей.

При выборе признаков, фенотипическое проявление которых могло бы дать информацию о генофонде популяции, большое значение имеют два показателя: генетический и экономический. Генетическая характери­стика генофонда включает степень наследуемости признаков, определяю­щую фенотипическую ценность популяции. Анализ генофонда популяции в первую очередь возможен именно по фенотипическим выражениям тех признаков, которые характеризуются высокой степенью наследуемости.

Экономическая характеристика генофонда имеет важное значение при изучении лесного генофонда по хозяйственно-ценным признакам. Но при этом не следует забывать, что в настоящее время еще невозможно уве­ренно прогнозировать экономическую ценность многих признаков для бу­дущего. Это во многом зависит от уровня развития промышленности по использованию и переработке древесины и других полезностей лесных древесных растений в будущем.

Лесные ресурсы нашей страны отличаются не только большими за­пасами древесины, но и большим разнообразием древесных пород, произ­растающих на обширных площадях в различных климатических зонах. Это определяет высокую степень внутривидовой изменчивости и генетическо­го полиморфизма отечественных видов, что свидетельствует о суще­ствовании в пределах вида хозяйственно полезных форм. Интенсивное развитие лесопользования, особенно сплошнолесосечные промышленные рубки, ведет за собой постепенное снижение видового многообразия, со­кращение и в ряде случаев исчезновение ценных форм и даже ценных по­пуляций. Поэтому овладение методами изучения генофонда позволит раз­работать соответствующие подходы к его сохранению и рациональному использованию.

Изучение генетических ресурсов (генофонда) начинается с установ­ления объема и границ популяций данного вида.

Следующим этапом изучения генофонда является оценка внутрипопуляционной структуры с выделением хозяйственно-ценных форм и особей.

Основные методы сохранения генофонда

1. создание генетических резерватов;
2. создание коллекционных культур;
3. сохранение уникальных и элитных деревьев;
4. сохранение семян, пыльцы и меристемы в специальных хранилищах. Для современного лесного хозяйства практическую ценность имеют первые три метода.

Источник