51. Молекулярная биология Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.
Ответ. Одной из основных проблем при получении трансгенных растений был способ введения чужеродных генов в хромосомы растений, т. е. трансформация растительных клеток. Значительный прорыв был сделан при открытии возможности использования природной системы трансформации растений Ti-плазмидами почвенных агробактерий. Ранее было известно, что некоторые виды почвенных бактерий (Agrobacleria) могут заражать двудольные растения и вызывать при этом образование специфических опухолей – корончатых галлов. Опухоли состоят из дедифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. При культивировании in vitro клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Помимо повышенного синтеза фитогормонов, опухолевые клетки корончатых галлов начинают синтезировать необычные для растения соединения – опины (производные аминокислоты аргинина), которые используются агробактериями в качестве источника азота и углерода. Агробактерии сами синтезировать опины не могут, так как промежуточные продукты синтеза ингибируют рост бактериальной клетки и используют растительные клетки как «фабрики» по производству опинов. При заражении растения агробактерией происходит перестройка метаболизма трансформированных растительных клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий. Опины не могут утилизироваться растительной клеткой и выделяются в межклетники, где и поглощаются агробактерией. Также ряд бактерий могут содержать агропиновые Ti—плазмиды, кодирующие агропин, также относящийся к опинам. Молекулярно-генетические исследования показали, что все Ti-плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две группы: необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т. д.); необходимые для трансформации растительной клетки. Гены первой группы имеют прокариотический тип промотора, т. е. могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы – могут экспрессироваться в эукариотической растительной клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индукцию опухоли и синтез опиновых аминокислот. Трансформация растения в результате агробактериального заражения происходит в несколько этапов. Сама агробактерия не входит в растительную клетку, она располагается в межклетниках. Не входит в клетку растений и Ti-плазмида, но часть Ti-плазмиды переносится в ядро растительной клетки и может встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент Ti-плазмиды был назван Т-ДНК (трансформирующая ДНК). На концах Т-ДНК находятся прямые высоко консервативные повторы (25 н.п.), составляющие, так называемые, левый и правый пограничные районы, которые необходимы для вырезания ее из состава плазмиды и интеграции в геном растений. Непосредственно границы области Т-ДНК, а также последовательности, примыкающие к этим районам, оказывают влияние на результативность трансформации. При этом, именно последовательность правой границы необходима для интеграции Т-ДНК в геном растения. Деления левой границы не оказывала существенного эффекта на перенос Т-ДНК. Также рядом с правой границей внутри области Т-ДНК располагается специфическая область, влияющая на вирулентность Ti-плазмиды. Деления этой области приводит к тому, что такие Ti-плазмиды не способны индуцировать опухолеобразование.
Для продолжения скачивания необходимо пройти капчу:
Источник
Дайте характеристику Ti-плазмиде как вектору для генетической трансформации растений.
Самый простой способ использования природной способности Ti-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя нуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Ti-плазмид и A. tumefaciens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Ti-плазмиды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования:
• Фитогормоны, синтезируемые трансформированными клетками в культуре, подавляют регенерацию из этих клеток зрелого растения, поэтому при конструировании векторов на основе Ti-плазмиды гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.
• Ген опина несуществен для трансгенных растений, но при его наличии может снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опина. Следовательно, при создании векторов ген опина также должен быть удален.
• Ti-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.
• Ti-плазмиды не реплицируются в Escherichia coli, что исключает работу с рекомбинантными Ti-плазмидами в этих бактериях. Следовательно, при конструировании векторов на основе Ti-плазмид необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их поддержание в Е. coli.
Несмотря на все эти сложности было сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и имеют следующие элементы:
• Селективный маркерный ген, например ген устойчивости трансформированных растительных клеток к канамицину. Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции
• Сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens.
• Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности.
• Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.
Поскольку клонирующие векторы не содержат генов vir, они сами не способны обеспечивать транспорт и интеграцию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработано два подхода.
1. В первом случае используют бинарную векторную систему. Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации и для Е. coli, и для A. tumefaciens, но не несет генов vir, т. е. это практически челночный вектор Е. coli — A. tumefaciens. Все стадии клонирования прово дят в Е. coli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens. Штамм-реципиент A. tumefaciens несет модифицированную неонкогенную («разоруженную») Ti-плазмиду; она содержит полный набор v/r-генов, но из нее удалена часть (или вся) Т-ДНК (так что Т-ДНК не может быть транспортирована). В этой системе на неонкогенной Ti-плазмиде синтезируются продукты v/r-генов, которые мобилизуют участок Т-ДНК бинарного клонирующего вектора. Продуцируя белки, кодируемые v/r-генами, неонкогенная Ti-плазмида выступает в роли помощника, способствуя встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения.
2. Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Векторная ДНК рекомбинирует в A. tumefaciens с «разоруженной» Ti-плазмидой, Т-ДНК которой не несет опухолеродных генов, таким образом, что весь клонирующий вектор встраивается в неонкогенную Ti-плазмиду. Коинтегративный вектор и неонкогенная Ti-плазмида-помощник содержат гомологичные последовательности, которые образуют сайт для гомологичной рекомбинации in vivo. Обычно эти последовательности расположены в Т-ДНК. После рекомбинации клонирующий вектор становится частью неонкогенной Ti-плазмиды, которая содержит v/r-гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительную хозяйскую клетку. Единственный способ поддержания клонирующего вектора в A. tumefaciens — это использование такой коинтегративной структуры. В данной конфигурации генетически сконструированный участок Т-ДНК может быть перенесен в растительные клетки.
Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:
Источник