Генетические векторы
Под понятием «вектор» понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.
Векторные молекулы должны обладать следующими свойствами:
1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном;
2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые признаки, позволяющие отличить трансформированные клетки от исходных;
3) содержать по одному или, самое большее, по два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов), но не в области, ответственной за их репликацию.
В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток. [4]
В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений, векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственно сконструированных векторов, способных реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).
Плазмиды — это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A.
Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса. Многие природные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (продукты этих генов — ферменты, модифицирующие или расщепляющие антибиотические вещества). Кроме того, в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнительные гены, определяющие устойчивость к другим антибиотикам. [5]
В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда других грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter), грамположительных бактерий (Bacillus), низших грибов (дрожжи) и растений.
В качестве примера рассмотрим процесс клонирования участка чужеродной ДНК бактерией E. coli при помощи
искусственная плазмида, созданная Франциско Боливаром и Раймондом Родригесом с целью клонирования генетического материала. Она представляет собой циклический фрагмент ДНК длиной 4361 нуклеотидных пары Плазмида содержит ген устойчивости к тетрациклину tеt, взятый из естественной плазмиды pSC 101; ген устойчивости к ампициллину amp, взятый из транспозона Tn3(Транспозоны (англ. transposable element, transposon) — это участки ДНК организмов, способные к передвижению (транспозиции) и размножению в пределах генома) ; и участок начала репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB 1. Тетрациклин и ампициллин — сильные антибиотики. Наличие в плазмиде генов устойчивости к ним (активных или блокированных) играет существенную роль в выделении бактерий со встроенным участком чужеродной ДНК. Плазмида содержит также сайты рестрикции Pst I, Bam HI и Sal I, причём первый находится в гене amp, а два остальных — в гене tet. Это важное обстоятельство помогает модифицировать плазмиду.
Предположим, что в плазмиду необходимо встроить фрагмент, который ранее был вырезан из другой ДНК рестриктазой Bam HI (то есть он имеет на концах последовательность нуклеотидов, характерную для сайта рестрикции Bam HI). Для этого плазмиды обрабатываются рестриктазой Bam HI, (которая разрежет кольцевую молекулу в сайте рестрикции и образует линейный участок ДНК) и добавляются участки чужеродной ДНК. Поскольку на концах всех фрагментов ДНК находятся комплементарные последовательности нуклеотидов, они начнут «склеиваться», причём возможны два варианта склейки (рис. 2) :
- Соединятся концы линейной плазмиды pBR 322, образовав исходную (восстановленную) кольцевую плазмиду.
- Между концами линейной плазмиды pBR 322 вклинится участок чужеродной ДНК, образовав кольцевую плазмиду со встроенным фрагментом.
- Плазмиды внедряются в клетки E. coli. Для этого клетки обрабатываются ионами Ca 2+ , что делает их мембраны проницаемыми для ДНК. Однозначного объяснения того, как Ca2+ помогает ДНК проникать внутрь бактерии нет:
- Полученные бактерии высевают на среду, содержащую ампициллин. В этой среде нормально растут колонии бактерий, содержащие плазмиды, остальные колонии угнетаются. По этому признаку можно отличить бактерии, содержащие плазмиды;
- Колонии, содержащие плазмиды, перепечатываются на среду, содержащую тетрациклин. Поскольку чужеродная ДНК вклинивается внутрь генаtet, дезактивируя его, колонии бактерий с модифицированными плазмидами угнетаются тетрациклином. Таким образом они визуально отличимы от колоний бактерий с восстановленными плазмидами.
- В результате этих действий выделяются колонии E. coli, в плазмиды которых встроен участок чужеродной ДНК. Они высеваются в обычную среду для дальнейшего клонирования.
Источник
50. Векторы для клонирования в растениях.
Ответ. Традиционные методы селекции, основанные, главным образом, на половой гибридизации и отборе, позволяют получать новые ценные генотипы растений. На их основе создано большинство современных сортов и гибридов сельскохозяйственных культур, в том числе шедевров отечественной и мировой селекции. Вместе с тем для повышения устойчивости сортов и гибридов к биотическим и абиотическим стрессам необходимо использовать новые методы, основанные на получении принципиально новых форм растений с помощью трансгенных технологий. Это, прежде всего, позволит значительно сократить сроки создания новых сортов и гибридов. Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены как прокариотического, так и эукариотического происхождения, переносить их в хромосомы реципиентных растений и обеспечивать экспрессию генов. Применение технологий генной инженерии делает поиск более целенаправленным изначально, расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом. Важным преимуществом растений по сравнению с животными является возможность получения целого растения из одной клетки, основанная на ее способности к тотипотентности-регенерации целого организма из одной клетки. Результаты генетической инженерии растений во многом зависят от разработки методов культуры тканей, особенно методик регенерации различных растений. Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов получения трансгенных растений: поиск, идентификация, выбор гена и его клонирование; подбор генотипа растения-реципиента; введение гена в геном клеток растения-реципиента; регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений; тестирование экспрессии гена в геноме трансгенного растения. Идентификация и клонирование гена. Выбор гена определяется необходимостью передачи растению определенного хозяйственно-полезного признака. В настоящее время для трансформации растений используются в основном гены, определяющие моногенные признаки, такие, как устойчивость к гербицидам и пестицидам, устойчивость к некоторым другим видам стрессов. Большинство генов, определяющих эти признаки, выделены из бактериальных геномов. В последнее время в качестве доноров генов, определяющих признаки устойчивости, выбирают геномы диких видов. Такие гены не могут быть введены в геном растений-реципиентов путем половой гибридизации из-за биологической несовместимости растений, относящихся к разным видам, родам и даже семействам. Еще более сложной является проблема получения признаков, относящихся к группе количественных признаков: продуктивность, качество зерна, устойчивость к засухе, низким и высоким температурам. Подбор генотипа растения-реципиента. В идеальном варианте в качестве реципиента подбираются растения такого сорта или линии, которые отвечали бы требованиям производства по урожайности, качеству плодов, устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам, но имели бы лишь одно отрицательное свойство, например неустойчивость к насекомым. Тогда введение в геном растений этого сорта, например, бактериального гена bt2, экспрессирующего белок прототоксин, вызывающий гибель насекомых, приводил бы к значительному улучшению выбранного сорта. Выбор генотипа растения-реципиента определяется способностью его клеток к регенерации в целое фертильное растение, так как показано, что это свойство значительно зависит от генотипа. Введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента. Проблема переноса чужеродных генов в геном растений существенно облегчается в связи с обнаружением Ti-плазмид почвенных агробактерий Agrobacterium tumefaciens, позволяющих вводить чужеродные гены в геном двудольных и некоторых однодольных растений. В последнее время довольно широко, особенно для трансформации клеток однодольных растений, используется метод биобаллистической трансформации. Важно обеспечить экспрессию чужеродного гена в геноме растения-реципиента и стабильное наследование признака в поколениях. Экспрессия введенного гена зависит от ряда причин, в том числе от места интеграции гена в геном растения, последующего метилирования промоторной области и введенного гена и т. п. Использование методов генной инженерии позволяет решать разнообразные селекционные задачи. Особенно большие успехи достигнуты при переносе в растения генов устойчивости к болезням, вредителям, гербицидам и др.
Источник