Выделение митохондрий из растений

Биология и медицина

Несмотря на то, что неопровержимые доказательства существования у дрожжей и дрожжеподобных организмов гранул, не отличимых по своей структуре от митохондрий высших организмов, были получены с помощью светооптической и электронной микроскопии уже давно (см. выше), выделение функционально полноценных митохондрий стало возможным лишь в 60-х годах [см. Котельникова ea 1973 ], т. е. через 20 лет после выделения нативных митохондрий из животных тканей и через 10 лет после получения интактных растительных митохондрий. Основная причина такого отставания кроется в наличии у дрожжей чрезвычайно прочной клеточной стенки и вследствие этого невозможности использования традиционных мягких методов разрушения тканей для получения интактных препаратов. Применяемые обычно методы выделения дрожжевых митохондрий основаны на двух принципах разрушения дрожжевых клеток — механическом и ферментативном. Наряду с методами, предложенными пионерами в области изучения окислительного фосфорилирования в дрожжевых митохондриях — встряхиванием клеток со стеклянными бусинками в шейкерах или высокоскоростных гомогенизаторах [см. Котельникова ea 1973 ], в последнее время широкое распространение получили способы разрушения клеток с помощью проточных дезинтеграторов с вращающимися дисками, различного рода мельниц, фракционаторов, экструзионных дезынтеграторов, гомогенизирование замороженных клеток при температуре жидкого азота, разрушение их под давлением [см. Звягильcкая ea 1980 , Котельникова ea 1973 , Deters ea 1976 , Deters ea 1978 , Lloyd ea 1974 , Pena ea 1977 ]. Выделение интактных органелл из гетерогенной популяции достигается многократным дифференциальным центрифугированием. Механические методы разрушения просты, универсальны, однако длительность процедуры отделения интактных митохондрий от поврежденных органелл или разрушенных фрагментов, а самое главное — низкий выход интактных структур (существует обратная зависимость между продолжительностью обработки и степенью интактности), создают определенные ограничения для использования этих методов. С помощью ферментативных методов удается лизировать клеточную стенку дрожжей под действием комплекса ферментов пищеварительного сока виноградной улитки , глузулазы , хеликазы или ферментов из бактерий и ферментов актиномицетов [см. Звягильcкая ea 1980 , Котельникова ea 1973 , Lloyd ea 1974 , Ohnishi ea 1966 ]. Образующиеся при этом протопласты (сферопласты) представляют собой осмотически нестабильные образования и могут быть легко разрушены с помощью осмотического шока или мягким гомогенизированием. Митохондрии, получаемые с помощью ферментативного метода, отвечают критериям физиологической интактности (они имеют почти столь же высокие величины ADP/0 и величину дыхательного контроля , как и митохондрии животных [см. Hagihara ea 1960 ]), однако широкое применение ферментативного метода ограничено тем, что даже незначительные изменения в физиологическом состоянии клеток сопровождаются появлением частичной резистентности к действию литических ферментов. Предварительная обработка клеток тиоловыми соединениями ( цистеином , 3-меркаптоэтанолом , дитиотреитолом ) в щелочной среде часто оказывается полезной для преодоления устойчивости к действию литических ферментов. Выбор наиболее оптимального варианта должен, по-видимому, определяться структурно-химическими особенностями исследуемых клеток (размеры клеток, величина и прочность клеточной стенки, ее химический состав и т. д.), а также конкретными целями исследования.

В ряде случаев очень плодотворным оказалось сочетание ферментативного и механического методов разрушения [см. Звягильская ea 1983 , Звягильская ea 1977 , Звягильская ea 1974 , Звягильcкая ea 1980 , Котельникова ea 1973 ]. При этом используется кратковременная обработка клеток хеликазой , при которой еще не происходит образования протопластов (сферопластов), но клетки имеют уже менее прочную, по сравнению с исходными, оболочку. Такие клетки, в отличие от нестабильных протопластов, устойчивы при промывании и в то же время легко разрушаются при кратковременном гомогенизировании. Выход интактных митохондрий при использовании комбинированного метода примерно в 2,5-3 раза выше, чем при механическом способе разрушения.

Ссылки:

Источник

Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез

Выделение митохондрий, метод полярографического анализа их энергетической активности. Уровни структурной организации белка, процесс его выделения и очистки. Особенности электрофореза белков в полиакриламидном геле и их иммуноэлектрофореза в агарозе.

Рубрика	Биология и естествознание
Предмет	Физиология и биохимия растений
Вид	учебное пособие
Язык	русский
Прислал(а)	Т.П. Побежимова
Дата добавления	05.07.2013
Размер файла	1,3 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Подобные документы

Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.

Исследование функциональной роли и структурной организации митохондрий. Рассмотрение и характеристика работы дыхательной цепи митохондрий в условиях нормоксии. Ознакомление с антигипоксическим действием нейротрофического фактора головного мозга.

Сущность ультраструктурной организации митохондрий. Роль митохондрий в поддержании окислительно-восстановительного баланса клетки. Специфика энергетических функций митохондрий. Изменение морфофункциональных характеристик митохондрий при ацидозе.

Электрофоретическая подвижность белка, влияющие факторов и условия электрофореза. Сущность метода полного разделения сложной смеси белков. Извлечение белков из геля после электрофореза. Гели агарозы и их применения. Влияние вторичной структуры ДНК.

Структура мембранных белков. Очистка интегральных мембранных белков и получение их в биохимически активной форме. Необходимость поддержания концентрации детергента. Электрофорез в полиакриламидном геле. Связывание детергентов с мембранными белками.

Источник

Методы изучения митохондрий растений, Полярография и электрофорез, Побежимова Т.П., Колесниченко А.В., Грабельных О.И., 2004

Методы изучения митохондрий растений, Полярография и электрофорез, Побежимова Т.П., Колесниченко А.В., Грабельных О.И., 2004.

Быстрое развитие теоретических работ в области физиологии и биохимии растений и разработка новых экспериментальных методов исследования органелл растительной клетки требуют постоянного совершенствования методической подготовки исследователей-биологов. Изучение биоэнергетики растений на современном уровне связано с применением сложных методов выделения и анализа митохондрий растений. В то же время выделение функционально активных митохондрий растений имеет ряд особенностей и связано с преодолением определенных методических трудностей. В связи с этим возникла необходимость сведения в одном издании рекомендаций, основанных на нашем опыте многолетней работы по изучению растительных митохондрий.
Книга предназначена для студентов — биологов, аспирантов, преподавателей, ведущих подготовку специалистов по физиологии и биохимии растений и молекулярной биологии, а также научных сотрудников, проводящих экспериментальные работы в области физиологии и биохимии растений.

ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ.
Получение функционально активных митохондрий из растений связано с рядом определенных трудностей. В первую очередь, к ним относится наличие плотных и жестких клеточных оболочек, вызывающих механические повреждения при растирании клеток. Отрицательную роль играют кислая реакция клеточного сока, выделяющегося в процессе гомогенизации ткани, а также содержащиеся в значительном количестве во многих растительных клетках фенольные соединения, являющиеся разобщающими агентами и ингибиторами. Другие особенности растительных тканей, например высокое содержание крахмала, хлорофилла, масел и т.д., также оказывают влияние на качество и чистоту изолированной митохондриальной фракции. Поэтому для получения интактных митохондрий в каждом конкретном случае в зависимости от объекта и его физиологического состояния необходимо подбирать оптимальные условия выделения органелл.

Процедура выделения митохондрий включает четыре этапа: 1) гомогенизация; 2) отделение митохондриальной фракции методом дифференциального центрифугирования; 3) очистка полученной фракции путем повторного промывания; 4) определение чистоты и качества полученного препарата митохондрий. Все операции по выделению митохондрий должны проводиться в строго контролируемых условиях, при температуре 0-4°С, для чего необходимо иметь криостат (Рис. 4) и рефрижераторные центрифуги. Во время всей процедуры выделения органелл как растворы, так и посуда должны находиться в воде со льдом.

СОДЕРЖАНИЕ.
1. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ И АНАЛИЗ ИХ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.
1.1 ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ.
1.2 МЕТОД ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ.
2. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ.
2.1 ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО БЕЛКА.
2.2 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ (ПААГ С ДДС-NA) (ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ).
2.3 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ НАТИВНОГО БЕЛКА В ГРАДИЕНТЕ ПОРИСТОСТИ ГЕЛЯ.
2.4 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ НАТИВНОГО БЕЛКА СО СДВИГОМ ЗАРЯДА.
2.5 БЛОТТИНГ.
2.6 ХОД ПРОВЕДЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА.
3. ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
3.1 ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОЗЕ.
3.2 ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ.
3.3 РОКЕТ-ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ.
4. РАБОТА С ПРИБОРАМИ.
5. СПРАВОЧНЫЕ ДАННЫЕ.

Скачать pdf
Ниже можно купить эту книгу по лучшей цене со скидкой с доставкой по всей России. Купить эту книгу

Источник

Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез

Выделение митохондрий, метод полярографического анализа их энергетической активности. Уровни структурной организации белка, процесс его выделения и очистки. Особенности электрофореза белков в полиакриламидном геле и их иммуноэлектрофореза в агарозе.

Рубрика	Биология и естествознание
Предмет	Физиология и биохимия растений
Вид	учебное пособие
Язык	русский
Прислал(а)	Т.П. Побежимова
Дата добавления	05.07.2013
Размер файла	1,3 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Подобные документы

Электрофорез как один из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. Электрофорез белков в полиакриламидном и агарозном геле. Оборудование для проведения капиллярного электрофореза.

Исследование функциональной роли и структурной организации митохондрий. Рассмотрение и характеристика работы дыхательной цепи митохондрий в условиях нормоксии. Ознакомление с антигипоксическим действием нейротрофического фактора головного мозга.

Сущность ультраструктурной организации митохондрий. Роль митохондрий в поддержании окислительно-восстановительного баланса клетки. Специфика энергетических функций митохондрий. Изменение морфофункциональных характеристик митохондрий при ацидозе.

Электрофоретическая подвижность белка, влияющие факторов и условия электрофореза. Сущность метода полного разделения сложной смеси белков. Извлечение белков из геля после электрофореза. Гели агарозы и их применения. Влияние вторичной структуры ДНК.

Структура мембранных белков. Очистка интегральных мембранных белков и получение их в биохимически активной форме. Необходимость поддержания концентрации детергента. Электрофорез в полиакриламидном геле. Связывание детергентов с мембранными белками.

Источник